Projets

Obtenir des propriétés optimales à différents endroits d'une structure est un grand enjeu de fabrication ou de réparation additive métallique. Cela repose sur une connaissance approfondie des liens entre propriétés et microstructures et un contrôle de ces dernières durant tout le procédé. Elle repose sur la maitrise à différentes échelles de temps et d’espace, des conditions de solidification ainsi que de l’évolution de la microstructure pendant les cycles thermomécaniques successifs. Le projet MIFASOL a pour objectif d’élaborer des stratégies de fabrication permettant de piloter conjointement la géométrie et la microstructure pour des procédés de dépôt de matière sous énergie concentrée (DED). Cependant, de telles stratégies se heurtent à trois principaux verrous scientifiques et techniques. Le premier tient au fait que toute stratégie de contrôle nécessite des simulations prédictives de la formation et de l’évolution de la microstructure pendant le procédé à l’échelle de l’objet. Le second tient aux stratégies de contrôle en temps réel nécessaires afin d’ajuster les paramètres du procédé pour éviter une dérive de la cinétique thermique. Le troisième verrou vise à définir la stratégie de fabrication et maitriser l’évolution des paramètres procédés pour garantir la géométrie et la microstructure. Le projet propose donc : 1) des modèles rapides couplant thermique et formation/évolution de microstructure à l’échelle du procédé dans son ensemble, permettant d’établir une stratégie de fabrication, 2) des mesures in-situ couplées à des algorithmes d’apprentissage pour corriger en temps réel la stratégie de fabrication et 3) une modélisation et un contrôle précis de la cinématique du dépôt de matière afin de définir au mieux la stratégie de fabrication dans le cas de structures complexes. Les résultats escomptés du projet sont : 1) un outil de calcul rapide efficace pour simuler les transferts thermiques en fonction de l’ensemble des paramètres du procédé ainsi que la formation et l’évolution des microstructures dans la pièce, 2) un montage expérimental permettant la mesure thermique in-situ d’une grande partie de la pièce en cours de procédé ainsi qu’un réseau de neurones (entrainé sur un grand nombre de simulations) permettant d’exploiter cette mesure en temps réel pour corriger les paramètres de fabrication et atteindre la microstructure souhaitée et 3) la réalisation d’un jumeau numérique s’appuyant sur la chaîne numérique de fabrication additive, intégrant les modèles de connaissance et de comportement permettant la synthèse de stratégies de dépôts en effectuant du virtual testing du procédé en amont de la production ou en temps réel en couplant les modèles numériques et les mesures in-situ. Le projet MIFASOL choisit donc résolument de travailler sur différentes voies d’analyses complémentaires : mesures et analyses en temps réel associées à des simulations rapides du procédé en vue d’un contrôle de la commande. Il s’intéresse donc aux matériaux et aux procédés, mais en étant résolument tourné vers des instrumentations innovantes de mesure et de contrôle, des techniques d'apprentissage de contrôle-commande par réseaux de neurones en vue d’une meilleure intégration de la fabrication additive parmi les technologies innovantes permettant une optimisation simultanée du matériau, de sa microstructure et de la pièce fabriquée. La réussite du projet repose donc sur la parfaite complémentarité entre les partenaires du projet et par le recrutement de deux doctorants dans le cadre du projet, l’un chargé de faire le lien entre les modèles rapides et les stratégies de fabrication en vue d’aller vers l’élaboration d’un jumeau numérique et le second chargé de la réalisation de mesures quantitatives in-situ couplées à un contrôle en temps réel par réseau de neurones.

L'objectif est de cre´er de nouveaux outils permettant des mesures intracellulaires a` l'e´chelle du nanome`tre de la structure des prote´ines par double re´sonance e´lectronique pulse´e (PELDOR). Des acides amine´s classiques ou non-naturels (UAAs) seront utilise´s pour introduire dans des prote´ines des e´tiquettes de spin Mn(II) et Gd(III) paramagne´tiques, ge´ne´tiquement codables et capables d'auto-assemblage. Jusqu'ici, l'approche la plus courante a e´te´ de greffer des radicaux nitroxyde aux cyste´ines pre´sentes naturellement sur les prote´ines ou introduites par mutage´ne`se dirige´e. Cette approche a 4 inconve´nients majeurs : 1) l'usage de cyste´ines est proble´matique pour les prote´ines ayant de´ja` des cyste´ines importantes pour la structure ou la fonction; 2) la stabilite´ et la dure´e de vie des nitroxydes sont fortement diminue´es par le milieu cellulaire re´ducteur; 3) le marquage intracellulaire est tre`s difficile a` cause de l'encombrement du milieu; 4) les proprie´te´s magne´tiques des radicaux ne permettent pas d'exploiter la sensibilite´ supe´rieure des hauts champs magne´tiques. L'utilisation d'ions me´talliques stables et de UAAs permettra de surmonter ces inconve´nients. Nous exploiterons la biologie mole´culaire classique et les nouvelles techniques d'expansion du code ge´ne´tique pour introduire de manie`re cible´e des complexes prote´iques porteurs de fonctionnalite´s qui formeront des e´tiquettes paramagne´tiques a` l'inte´rieur des cellules. Cette approche e´vitera l'isolation et la modification post-translationnelle et permettra une de´tection dans la cellule, rendant inutiles les proce´dures invasives utilise´es actuellement pour introduire des prote´ines marque´es dans les cellules. La premie`re strate´gie de´veloppera l'utilisation de courtes se´quences aminoacide. Nous avons re´cemment montre´ que deux e´tiquettes de spin me´talliques peuvent e^tre ge´ne´tiquement introduites sur une me^me prote´ine, assemble´es et la distance les se´parant mesure´e dans la cellule sans intervention supple´mentaire (isolation, purification ou transformation chimique), ceci en introduisant des se´quences Lanthanide Binding Tags (LBT), puis par incubation de la culture cellulaire en pre´sence de Gd(III). Le Mn(II) fixe´ a` des e´tiquettes His-tag peut aussi e^tre utilise´ comme marqueur de spin en conditions cellulaires, malgre´ la faible affinite´ de ces e´tiquettes pour Mn(II). L'ajout de Mn(II) et Gd(III) au milieu de culture n'affecte ni la croissance cellulaire, ni l'expression prote´ique ni la survie. Nous optimiserons cette approche en ame´liorant la fixation, la flexibilite´ et les proprie´te´s spectroscopiques des marqueurs de spin me´talliques auto-assembleurs (SAMSL). La deuxie`me strate´gie utilisera des UAAs et l'expansion du code ge´ne´tique pour introduire de nouvelles fonctions chimiques. Une premie`re approche consistera a` incorporer un UAA pour introduire en un site spe´cifique d’une prote´ine (ou sur une prote´ine spe´cifique avec une localisation particulie`re dans la cellule) une ancre a` laquelle une e´tiquette de spin peut e^tre fixe´e. Ceci n’est pas possible avec des cyste´ines. La deuxie`me approche utilisera un UAA pour cre´er un site de fixation de me´taux qui peut e^tre utilise´ comme SAMSL, un His- tag ou LBT, mais plus versatile et compact. Des UAAs capables de fixer des me´taux ont de´ja` e´te´ introduits dans des prote´ines. En exploitant ces strate´gies plus flexibles de marquage de spin par des me´taux, nous ferons des e´tudes intracellulaires de l'organisation tridimensionnelle de la ge´phyrine, une prote´ine de l'e´chafaudage synaptique, ainsi que de ses interactions avec les inhibiteurs récepteurs de la glycine (GlyR). L'objectif a` terme est de produire une boi^te a` outils robuste d'introduction par codage ge´ne´tique de marqueurs de spin me´talliques qui e´largira le champ d'application de la PELDOR in vitro et rendra les mesures intracellulaires plus courantes.

Afin de comprendre comment une plante grandit, il est indispensable d’étudier l’architecture et l’homéostasie mécanique du réseau de polymères constituant la paroi cellulaire. Les objectives de HOMEOWALL sont de combiner la biologie cellulaire, la biologie structurale, la physique de la matière molle et la modélisation numérique afin d’élucider l’architecture de la paroi cellulaire végétale à l’échelle nano- et mésométrique, les transitions de phase des polymères de la paroi contrôlant la croissance et le rôle dual d’un module récemment découvert (RALF/LRX/CrRLKL1) dans l’architecture et le contrôle des transitions de phase dans la paroi en expansion. Les résultats devraient soutenir un changement de paradigme dans la compréhension de l’expansion cellulaire et aboutir à une meilleure compréhension des interactions entre poly-électrolytes co-évolués, potentiellement inéressants pour la conception de nanomatériaux intelligents

Le chromosome eucaryote est un milieu complexe, à la fois dense et hétérogène, composé d'une longue chaîne d'ADN (quelques mm à quelques dizaines de cm selon les espèces), repliée dans le volume du noyau à l'échelle du micron, à travers plusieurs niveaux d'organisation, et tout en interagissant avec une multitude de facteurs conduisant à une compartimentation fonctionnelle, présentant des variations temporelles et spatiales. Leur structure fondamentale en « collier de perles » de nucléosomes joue un rôle essentiel dans la régulation de nombreux processus cellulaires essentiels (épigénétique, régulation de l’expression de gènes, réplication et réparation de l’ADN). Ces dernières années, la connaissance du chromosome s'est beaucoup développée grâce à l'essor des techniques de capture de conformation et des techniques de microscopie optique, mais sa structure à l’échelle nanométrique est encore presque inexplorée. En utilisant la cryo tomographie électronique de sections vitreuses nous avons récemment montré qu’il est possible de visualiser les nucléosomes et l'ADN à un niveau de détails permettant d'accéder à leur conformation dans le contexte cellulaire. Le projet CRYOCHROM propose une approche de biologie structurale intégrée visant à déterminer la conformation et l’organisation locale de la chromatine en lien avec sa compartimentation fonctionnelle. Il s'appuie sur un consortium multidisciplinaire, incluant des biologistes et biophysiciens de l’ADN et de la chromatine, des spécialistes de l’analyse d'image en cryo microscopie électronique, et de la modélisation en physique des polymères. Nous caractériserons la variabilité conformationnelle des nucléosomes et celle de leur organisation supramoléculaire. Nous explorerons les liens entre conformation des nucléosomes et repliement de la chromatine. Nous relierons conformation et ordre local avec les états fonctionnels de la chromatine en interphase, en ciblant les domaines d’euchromatine et d’hétérochromatine par corrélation entre cryo-microscopie de fluorescence et électronique. Pour caractériser les conformations et comprendre les mécanismes à l'oeuvre, nous combinerons analyses expérimentales, modèles théoriques et simulations.

Ce projet multidisciplinaire consiste en l’analyse mécanistique de processus spécifiques de la traduction mitochondriale chez les plantes. Nous nous intéresserons en particulier aux mécanismes liés à l’étape d’initiation traductionnelle, à l’organisation et à la structuration du mitoribosome de plante et à sa spécialisation dans la synthèse de protéines membranaires. Ces recherches sont motivées par le fait que les mitoribosomes ont des compositions et des structures très divergentes par rapport à leurs équivalents bactériens et eucaryotiques, sans que l’on sache aujourd’hui pourquoi. Par ailleurs, bien que les mitochondries aient une origine bactérienne lointaine, l’étape d’initiation traductionnelle dans ces organites implique des mécanismes encore incompris mais qui semblent avoir divergé à bien des titres par rapport aux mécanismes guidant l’initiation traductionnelle chez les bactéries. Afin de comprendre ces différences, nous effectuerons notamment une analyse structure-fonction du mitoribosome et étudierons les mécanismes assurant l’initiation traductionnelle dans les mitochondries de la plante modèle Arabidopsis thaliana. Le projet sera effectué par un consortium d'équipes expertes en génétique moléculaire, biochimie et biologie structurale. Il impliquera l’étude moléculaire et biochimique de plantes mutantes, de la cryo-microscopie électronique et du profilage de ribosomes. Les résultats obtenus permettront de mieux comprendre la diversité et l'évolution des mécanismes traductionnels chez les eucaryotes.

Les cassures double-brin (CDBs) sont parmi les lésions les plus toxiques de l’ADN. Paradoxalement, elles sont générées de façon intentionnelle lors des traitements par radiothérapie ou lors de l’édition de génomes par l’approche CRISPR-Cas9. La voie de réparation par jonction directe (c-NHEJ pour "classical Non-Homologous End Joining") est la voie principale de réparation humaine des CDBs. La génération maitrisée de CDBs nécessite une compréhension fine des bases moléculaires du c-NHEJ. L’hétérodimère Ku70/Ku80 (Ku) reconnait les CDBs et recrute de manière itérative de nombreux facteurs du c-NHEJ par des motifs conservés appelés KBMs (pour Ku Binding Motifs). Ku joue également un rôle central pour le maintien à proximité des deux extrémités de la CDB (appelée synapse) qui permet de prévenir des ligatures erronées. Les bases moléculaires de la chorégraphie spatiale et temporelle des facteurs du c-NHEJ autour de Ku sont encore mal connues Le projet BreakDance est centré sur l’étude de 6 facteurs du c-NHEJ qui contiennent un ou plusieurs motifs de type KBM. Ces facteurs sont les facteurs de ligature, XLF et PAXX, les nucléases APLF et WRN et les deux polymérases de la famille X, Pol mu et TdT. Les partenaires 1, 2 et 4 ont récemment montré par une étude structurale et fonctionnelle que les KBMs de APLF et XLF interagissent sur deux sites éloignés de Ku80, que le KBM de XLF entraine une large ouverture de Ku80 et enfin que APLF et XLF ont un rôle coopératif pour le c-NHEJ (Nemoz, 2018, NSMB). Auparavant, les partenaires 1 et 4 avaient également collaboré sur le KBM de PAXX et montré que ce motif interagit sur la sous-unité Ku70 (Tadi, 2016, Cell Reports). Un premier objectif est d’étendre la stratégie utilisée avec succès pour APLF et XLF à l’étude structure-fonction de l’interaction entre le complexe Ku/ADN et les KBMs de 4 autres facteurs du c-NHEJ. Nous étudierons par des approches structurales, biochimiques et cellulaires les KBM de PAXX, de WRN (qui en possède 3), et des polymérases X, Pol mu and TdT. Ceci permettra une cartographie complète de l’ensemble des sites d’interaction des KBMs sur Ku et mettra en évidence les synergies et compétitions entre les facteurs du c-NHEJ possédant des KBMs. Un second objectif est de positionner les protéines entières contenant des motifs KBM par rapport au complexe Ku/ADN afin d’évaluer la relation entre le site d’interaction des KBMs et le positionnement des sites fonctionnels de ces protéines. Nous nous concentrerons sur la protéine PAXX et sur des domaines de WRN en complexe avec Ku/ADN pour lesquels les partenaires 1 et 3 ont obtenu des premières classes 2D par cryoEM. Un troisième objectif concerne le maintien à proximité des extrémités d’une CDB en présence du complexe de ligature LIG4/XRCC4/XLF ou de polymérases X. Le consortium combinera ses expertises pour dévoiler les bases moléculaires de ces assemblages centraux du c-NHEJ. Le projet BreakDance comprend des objectifs et sous-objectifs de niveaux de difficultés différents. Les tâches sont partiellement indépendantes, peuvent être menées en parallèle et s’appuient sur de nombreuses données préliminaires. Notre consortium possède les expertises nécessaires en biologie structurale, cellulaire et biochimie pour mener avec succès les défis proposés. Le projet apportera également de nouveaux outils utiles à des projets sur la maintenance des génomes : méthodes robustes de production des protéines du c-NHEJ dans différents hôtes, ou large ensemble de tests fonctionnels du c-NHEJ in vitro et en cellules. Ce projet représentera une étape majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires d’assemblage des protéines du c-NHEJ autour d’une CDB. Il ouvrira la voie à la caractérisation de nouvelles molécules permettant d’augmenter l’efficacité des traitements par radiothérapie ou l’efficacité des méthodes d'édition des génomes.

La recombinaison homologue est un mécanisme universel impliqué dans la stabilité des génomes (réparation) et dans leur évolution (brassage intra-chromosomique). En méiose, elle permet la formation de crossing-overs (COs) essentiels à la ségrégation correcte des chromosomes homologues. Toute altération dans la formation ou la régulation des COs conduit à des défauts de fertilité ou à la formation de gamètes aneuploïdes. La recombinaison méiotique débute par la formation de cassures double brin de l’ADN (CDB) programmées tout le long du génome et leur réparation correcte est indispensable à l’appariement des chromosomes homologues ainsi qu’à la mise en place de la structure d’appariement, le complexe synaptonémal (CS). La réparation des CDBs en CO et non crossing-over (NCO) se fait préférentiellement en utilisant comme modèle le chromosome homologue. Le processus de recombinaison est donc une étape clé de la méiose qui doit être très fortement régulée. En particulier, le choix entre NCO et CO est crucial pour assurer la présence d’au moins un CO par paire d’homologues quelle que soit la taille des chromosomes. De plus, les COs sont espacés de façon régulière le long des chromosomes par le phénomène d’interférence : la désignation d’un CO à une position donnée diminue la probabilité d’avoir un autre CO à proximité. Le nombre de COs par paire d’homologues dépend donc de la force de l’interférence. Bien que le phénomène d’interférence ait été décrit pour la première fois en 1916, les mécanismes et les molécules impliquées ne sont toujours pas identifiés. Des approches génétiques et moléculaires ont permis d’identifier une voie de modulation partielle de l’interférence chez Saccharomyces cerevisiae qui implique la modification post-traductionnelle de deux protéines de l’axe chromosomique. Nos résultats préliminaires ont montré que cette voie était conservée chez Sordaria macrospora et que l’absence de trois acteurs de cette voie augmentait le nombre et modifiait la répartition des COs. Ces modifications sont associées à une modulation de la taille de l’axe des chromosomes. En s’appuyant sur ces résultats préliminaires robustes, le projet CO-PATT combine des approches multidisciplinaires, maîtrisées dans nos laboratoires et comporte trois objectifs : (1) Une caractérisation précise de cette voie chez S. macrospora et Arabidopsis thaliana en utilisant les approches très performantes d’imagerie sur cellule unique offertes par ces deux systèmes modèles. Ces approches permettront d’explorer la conservation évolutive de cette voie et des mécanismes associés. (2) Une caractérisation fonctionnelle de nouveaux acteurs impliqués dans la mise en place de l’interférence ou de sa régulation. Nous allons tirer parti de la complémentarité de nos trois systèmes : S. cerevisiae (crible génétique haut-débit et étude moléculaire de la recombinaison), S. macrosopora et A. thaliana (approches génétiques et cytologiques). (3) Une étude du rôle de l’axe du chromosome et du CS dans la transmission du signal de l’interférence. Nous combinerons les données du nombre et de la localisation des COs dans les divers contextes mutants avec des approches de modélisation afin de tester la propagation du signal d’interférence en présence et en absence de CS complet (défaut d’appariement). Le Projet CO-PATT devrait permettre de mieux comprendre les contraintes imposées par l’interférence dans la distribution des COs à l'échelle du chromosome et du génome. Les résultats de ce projet intéresseront la communauté scientifique étudiant la fertilité humaine ainsi que celle impliquée dans les programmes d’amélioration des plantes. Mieux maîtriser le nombre et la répartition des COs permettra par exemple : (i) l’obtention de gamètes hyper- ou hypo-recombinants plus adaptables aux environnements changeants, (ii) diminuer la taille des populations de sélection et (iii) réduire la taille des segments chromosomiques introduits dans les variétés élites.

Les mutations ont longtemps été difficiles à observer directement dans des cellules individuelles. Cela a empêché la caractérisation directe de leur dynamique et de leurs effets sur la valeur sélective, essentiels pour la plupart des études évolutives. Nous avons récemment développé une méthode permettant de visualiser l’apparition de mutations spontanées en temps réel dans des cellules individuelles de bactéries. Nous proposons ici d’utiliser cette approche pour caractériser les occurrences de mutations spontanées dans des génomes de bactéries et de phages au cours d’une infection. Nous allons examiner aussi si l’infection par des phages filamenteux module le taux de mutation bactérienne et comment cela pourra affecter la capacité d'adaptation de la cellule hôte. Ces résultats sont pertinents pour l'évolution et l'adaptation des phages et des bactéries et donc, en ce qui concerne la santé humaine, pour l'antibiorésistance et la thérapie phagique.

Les éléments transposables (ET) constituent une grande proportion des génomes eucaryotes. En raison de leur propension à se multiplier et à se déplacer, les ET représentent à la fois un moteur de l'évolution des génomes et une menace pour leur intégrité. Ainsi, la compréhension des mécanismes de répression et de réactivation des ET représente un enjeu majeur de la biologie moderne, en particulier pour la sélection végétale. Les connaissances actuelles indiquent que les transgènes sont soumis aux mêmes phases d’extinction que les copies d'ET nouvellement insérées, ce qui fait des transgènes d'excellents outils moléculaires pour étudier la répression des ET. Dans ce projet, nous suivrons des transgènes et ET activés pour déterminer comment la chromatine est assemblée sur l'ADN nouvellement inséré, quels types d'ARN sont produits pour activer la répression, comment cette répression se répand systématiquement dans la plante, et finalement comment elle se stabilise au cours des générations.

Les dysfonctions mitochondriales jouent un rôle crucial dans les pathologies métaboliques et neurodégénératives, le cancer et le vieillissement. En effet, les mitochondries sont des organites essentiels des cellules eucaryotes : elles permettent de fournir la majeure partie de l’énergie cellulaire grâce à la chaîne respiratoire, dont la biogenèse requiert l’expression coordonnée des génomes nucléaires et mitochondriaux (ADNmt). Le maintien et la transcription de l’ADNmt dépendent tous deux de l’ARN polymérase mitochondriale. En plus de sa partie catalytique, POLRMT dispose d’une extension N-terminale (NTE) dont la fonction in vivo est encore incomprise. Cette NTE contient plusieurs motifs du type « penta-trico peptide repeats », caractéristiques de protéines de liaison aux ARN jouant le rôle d’adaptateur pour médier les interactions entre des enzymes et leurs substrats ARN. De manière intéressante, l’étude de la structure cristalline de POLRMT suggère que, lors de leur sortie du complexe d’élongation de la transcription, les ARNs néo-synthétisés interagissent avec les motifs PPR de la NTE ; pour l’instant, il n’y a pas d’autre information sur le rôle de ces motifs PPR. De plus, les études in silico prédisent que plusieurs sites de phosphorylation sont présents dans POLRMT, pour la majorité dans la NTE, dont certains directement dans les motifs PPR. Ces sites de phosphorylations pourraient jouer un rôle régulateur, comme cela est le cas pour les ARN polymérases nucléaires, cependant actuellement on ne connait pas exactement quels sites sont phosphorylés in vivo ni quel est leur impact potentiel sur l’expression des gènes mitochondriaux. Enfin, deux facteurs ont été proposés comme interagissant avec POLRMT pour moduler son activité, sans que le mécanisme soit connu, et il est probable qu’il existe encore d’autres partenaires de POLRMT à découvrir. Le projet MitoPoNT vise à éclaircir le rôle de l’énigmatique NTE de POLRMT et de ses motifs PPR. En particulier, nous voulons déterminer comment cette NTE pourrait moduler la fonction de POLRMT et médier un couplage entre la transcription et les étapes post-transcriptionnelles de l’expression des gènes mitochondriaux, via des modifications post-traductionnelles mais aussi par interaction en trans avec des partenaires protéiques. En utilisant des cultures cellulaires et des tissus murins, nous mènerons trois axes de recherche : (1) l’étude fonctionnelle des motifs PPR de POLRMT de mammifère en utilisant comme outil un modèle levure et en générant des variants par mutagenèse dirigée ; (2) l’investigation des sites de phosphorylation in vivo de POLRMT en utilisant une stratégie innovante de protéomique ciblée ; (3) la recherche de nouvelles protéines de mammifère interagissant avec POLRMT pour réguler sa fonction, en utilisant un modèle souris exprimant une version étiquetée de POLRMT. Ces travaux permettront de mieux comprendre le rôle régulateur de POLRMT mais aussi de découvrir de nouvelles protéines partenaires et d’élucider leur fonction dans l’expression des gènes mitochondriaux. En plus de cette importance indéniable en recherche fondamentale, ce projet est aussi particulièrement pertinent au niveau appliqué, en médecine humaine. En effet, non seulement il existe un grand nombre de pathologies humaines associées avec des dysfonctions mitochondriales, dont des défauts de POLRMT comme cela a été reporté très récemment, mais il a aussi été proposé d’utiliser POLRMT comme future cible thérapeutique pour combattre le cancer.

Les récentes études sur la structure du crâne et des dents des homininés fossiles et actuels ont démontré que des informations (paléo)biologiques précieuses peuvent être extraites de ces tissus minéralisés pour estimer le statut taxinomique, les trajectoires évolutives et les relations phylogénétiques. Une composante génétique non-négligeable explique vraisemblablement la variation de nombreuses de leurs caractéristiques morphologiques. Cependant, l'architecture génomique de la structure crânio-dentaire reste encore méconnue chez l'humain et la compréhension des relations entre génotype et phénotype permettra de jeter une lumière nouvelle sur l’étude du registre paléoanthropologique. Le projet GenoMorph repose sur une approche multidisciplinaire exploitant données (paléo)génétiques et morphologiques issues de techniques d'imagerie par rayons X. L’objectif principal vise à comprendre les mécanismes génétiques sous-jacents dans l’évolution des structures crânio-dentaires chez l’humain.

La microcorie congénitale (MCOR) est une maladie rare dominante autosomique caractérisée par des micropupilles aréactives en raison d'une absence de muscle dilatateur de l'iris. Un glaucome et une myopie sont très fréquemment associés. Nos travaux ont révélé que cette maladie s'explique des mécanismes complexes de dérégulation 3D de l'expression d'un facteur de transcription. Ceci suggère que le glaucome et la myopie associées à la microcorie ne sont pas secondaires à l'anomalie du développement de l'iris mais résultent d'une dérégulation d'une voie métabolique non encore connue. La microcorie congénitale est par conséquent un modèle extrêmement précieux pour analyser à la fois le développement de l'iris, le glaucome et la myopie. La caractérisation de cette nouvelle voie devrait nous permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le glaucome.

Les contraintes environnementales telles que l'augmentation de la température et les infections virales ont des impacts majeurs sur les organismes vivants. Les plantes, comme d'autres espèces, développent divers mécanismes pour faire face aux effets de ces stress sur la croissance et la survie. L'homéostasie rédox fait partie des acteurs clés du métabolisme cellulaire et des réponses cellulaires aux contraintes environnementales. Il est sensible aux changements environnementaux et peut signaler ces changements aux voies de réponse, par exemple en modifiant le statut rédox des résidus de thiols des protéines. Dans les cellules eucaryotes, les petits ARN (siARN et miARN) sont les principaux régulateurs de l'expression des gènes, impliqués dans la plupart des processus de développement et de réponse au stress. La biogenèse des petits ARN est orchestrée par des endonucléases RNaseIII appelées DICER-LIKE (DCL) et RNASE THREE-LIKE (RTL), qui maturent presque toutes les classes de précurseurs d'ARN double brin. Par le passé, nous avons montré que l'activité RNaseIII des membres de la famille DCL et RTL chez Arabidopsis thaliana dépend de l'état d'oxydation des thiols de cystéine spécifiques. Récemment, grâce à des analyses du génome entier, nous avons montré que le répertoire des petits ARN change avec l'environnement rédox de la cellule, suggérant que la régulation rédox des RNaseIII pourrait signaler des changements environnementaux pour réguler le métabolisme des petits ARN. Dans le cadre du projet RoxRNase, nous déterminerons le mécanisme de régulation rédox des thiols des DCL et RTL, et les voies de réduction impliquées. L'objectif est de déterminer les bases moléculaires des mécanismes rédox impliqués dans la régulation de la biogenèse des petits ARN et de l'expression des gènes en réponse aux stress biotiques et abiotiques chez Arabidopsis. Plus précisément, le projet vise à élucider la façon dont l'environnement rédox cellulaire régule les activités RNaseIII impliquées dans la régulation épigénétique de l'expression des gènes lors de la réponse des plantes à une température élevée et à une infection virale, et à identifier des régulateurs rédox qui contrôlent ces modifications. Nous proposons d'abord d'identifier les modifications post-traductionnelles rédox des DCL et RTL d'Arabidopsis dans des conditions normales, biotiques (infection virale) et abiotiques (haute température) en utilisant des approches biochimiques et de spectrométrie de masse. Ensuite, nous examinerons les effets des modifications rédox sur l'activité des DCL et RTL, la localisation subcellulaire et la fonction dans la réponse des plantes aux conditions de stress en créant des mutations de substitution des résidus modifiés par le rédox des protéines DCL et RTL. Ensuite, nous étudierons les effets des modifications rédox sur l'accumulation de petits ARN et leur impact sur l'expression des gènes par séquençage à haut débit. Enfin, nous étudierons la signification biologique de la régulation rédox de DCL et RTL dans des conditions contrôlées de haute température et d'infection virale spécifique et évaluerons son impact sur la viabilité, le développement et la fertilité des plantes. Ainsi, ce projet visant à élucider les réseaux rédox-épigénétiques dans les plantes approfondira la compréhension actuelle de la façon dont les plantes s'adaptent ou résistent à l'environnement. Nous pensons que les résultats obtenus grâce à ce projet permettront d'établir un lien général et de découvrir les mécanismes moléculaires d'interaction entre la signalisation rédox, la régulation épigénétique et l'adaptation aux contraintes environnementales qui sont une préoccupation majeure pour tous les organismes vivants. Le projet RoxRNase rassemble des expertises complémentaires dans les domaines de la signalisation rédox, du métabolisme de l'ARN et de la régulation épigénétique des trois partenaires qui ont déjà bâti de solides collaborations qui garantiront le succès du projet.

Le maintien de l'intégrité du génome, de l'identité et du devenir des cellules dépend de l'exécution correcte et ordonnée de la réplication de l'ADN et de la ségrégation des chromosomes en mitose au cours des générations successives. La duplication de grands génomes pose des problèmes spécifiques en raison de la limitation de plusieurs composants de la machinerie de réplication et repose sur l'activation séquentielle d'origines de réplication suivant un ordre spatio-temporel précis. Bien qu'une activité globale Cdk (Cyclin-dependent kinase) soit requise pour l'exécution du programme d'initiation, les rôles respectifs des différents complexes, notamment CyclinA2-Cdk2 et CyclinA2-Cdk1, qui s'assemblent séquentiellement au cours de la phase S ainsi que les mécanismes de régulation sous-jacents restent très mal compris. Les cellules en prolifération sont régulièrement confrontées à diverses menaces qui affectent le processus de réplication du génome et conduisent à un ralentissement ou à un blocage des fourches, des situations communément appelées stress réplicatif (RS). Des travaux antérieurs ont établi que les cellules répondent au stress réplicatif en augmentant d'une part la densité des événements d'initiation pour achever la réplication déjà initiée de certains domaines chromatiniens, d'autre part en activant un point de contrôle de la réplication de l'ADN (DRC) qui inhibe les activités Cdk en phase S, bloquant ainsi l'initiation de domaines non encore répliqués et empêchant la progression plus avant du cycle cellulaire. Cependant, ces observations ne tiennent pas en compte le fait que le stress réplicatif en fonction de son intensité module probablement finement le niveau des activités CyclinA2-Cdk2 et/ou -Cdk1 et par conséquent la régulation d'événements d'initiation supplémentaires. Dans ce cadre, Nous avons observé dans certaines conditions que l'inhibition de Cdk1 déclenche des événements d'extra-initiation dans de grands gènes exprimés et répliqués tardivement, y compris ceux hébergeant des sites fragiles communs (CFS). Par conséquent, en plus de retarder l'entrée en mitose, l'inhibition de Cdk1 accélère la réplication de certaines régions difficiles à répliquer, supprimant leur instabilité. Nous avons d'autre part développé un senseur FRET (Förster Resonance Energy Transfer) spécifique de l'activité Chk1 pour analyser l'évolution de la signalisation DRC au cours du temps en cellules vivantes. Nos résultats montrent que l'activité Chk1 est étroitement modulée pendant une phase S normale ainsi qu'en réponse à un stress réplicatif croissant. De plus, nous avons observé des profils d'activité de Chk1 hétérogènes d'une cellule à l'autre au cours de la reprise du cycle cellulaire suite à un stress réplicatif, qui suggèrent une activation temporelle de mécanismes de réparation de l'ADN jusqu'à l'entrée des cellules en mitose. Dans le présent projet, nous proposons d'utiliser des cellules génétiquement modifiées afin de manipuler spécifiquement l'activité de complexes CyclinA2-Cdk individuels ainsi qu'un ensemble de senseurs FRET, notamment de l'activité Chk1 pour suivre la signalisation DRC, afin: (i) de décrypter le rôle des complexes CyclinA2-Cdk1 et CyclinA2-Cdk2 dans l'activation ou la répression d'origines de réplication en conditions normales ou suite à un stress réplicatif, (ii) de caractériser les mécanismes de réparation mise en œuvre pour préserver l'intégrité du génome lors de la récupération d'un stress réplicatif, (iii) d'élucider par quels mécanismes des régions non-répliquées du génome peuvent persister en mitose suite à un stress réplicatif, favorisant l'apparition d'une instabilité génomique.

Cette proposition vise à aborder les origines et l'évolution cellulaire profonde de la famille Arf de petites protéines G (Arf_F), fournissant de nouvelles informations sur l'eucaryogenèse, avec des implications importantes pour l'organisation cellulaire eucaryote. Les protéines eucaryotes Arf (Arf_E, composée des protéines Arf, Arl et Sar) sont des régulateurs essentiels de la structure et de la fonction du système endomembranaire, caractéristique des cellules eucaryotes. Une découverte récente et très intéressante est l’existence de protéines apparentées à Arf dans les lignées d’archées récemment découvertes (les archées Asgard), ce qui suggère que ces protéines étaient présentes dans l’ancêtre commun des archaea et des eucaryotes. Nous allons combiner les approches bioinformatique, biologique cellulaire, biochimique et structurelle pour tester l'hypothèse selon laquelle ces protéines prédites sont des GTPases Arf véritables. Pour atteindre cet objectif, nous allons tester si ces protéines prédites possèdent les aspects biochimiques caractéristiques des GTPases Arf_E qui permettent leur fonction. Les petites GTPases liées aux Arfs font partie des très rares composants de trafic membranaire présents chez les archées d’Asgard. L’existence des GTPases Arfs dans les archées suggère qu'elles constituent l'une des composants clés impliquées dans l'eucaryogenèse.

La recombinaison méiotique est un processus fondamental pour l’évolution des génomes, la dynamique de l’adaptation des caractères et la fitness. Les événements de recombinaison sont répartis irrégulièrement le long du génome et le nombre et la position des crossovers sont fortement régulés, mais les mécanismes sous-jacents sont encore mal connus. Les nombres de crossovers par chromosome sont très similaires entre espèces alors que la taille physique des chromosomes varie dans d’énormes proportions, mais on ne comprend pas les pressions de sélection sous-jacentes. Les inter-relations entre recombinaison et adaptation sont complexes car les crossovers peuvent influencer la vitesse d’évolution via l’utilisation de la diversité existante, et inversement le processus d’adaptation peut indirectement faire évoluer le nombre de crossovers. Par exemple, un niveau élevé de recombinaison peut accélérer l’adaptation en créant de nouvelles combinaisons d’allèles favorables, mais peut aussi provoquer un ‘fardeau de recombinaison’ en cassant de telles combinaisons, comme dans le cas de clusters de gènes co-évolués. Il existe de la variabilité intra-spécifique du nombre et de la répartition des crossovers, due au polymorphisme de gènes agissant en TRANS et de séquences génomiques agissant en CIS, ce qui suggère que le taux de recombinaison doit pouvoir répondre à une sélection directe. Ce projet s’intéresse : (1) à la capacité d’évolution du taux de recombinaison, (2) aux déterminants génétiques CIS et TRANS de la variation quantitative du nombre et de la répartition des crossovers, et (3) aux inter-relations entre recombinaison et adaptation au stress. En utilisant l’espèce modèle S. cerevisiae, qui a déjà joué un rôle majeur pour étudier la régulation de la recombinaison, nous proposons d‘identifier des facteurs génétiques qui déterminent le nombre et de distribution des crossovers. Pour cela, nous utiliserons des méthode et des ressources biologiques innovantes (souches fluorescentes et tri à haut-débit des cellules recombinantes par ‘Fluorescence-Activated Cell Sorting’, population ‘Multiparent Advanced Generation InterCross’) développées récemment par les partenaires du projet. Ces méthodes nous permettront pour la première fois de produire par sélection récurrente directionnelle des populations de levures ayant évolué pour des taux de recombinaison plus élevés ou plus faibles, et d’en étudier les conséquences sur la fitness. Nous pourrons ainsi identifier par ‘pool-seq’ les déterminants génétiques en TRANS sous-jacents à la réponse à la sélection sur la recombinaison, en étudiant les fréquences alléliques parentales le long du génome. Nous étudierons aussi les profils de recombinaison génome-entier à très haute résolution par séquençage de tétrades, pour étudier l’effet des séquences agissant en CIS sur ces profils. L’expérience de sélection récurrente produira des populations avec à la fois une base génétique large et des valeurs moyennes de recombinaison soit hautes, soit basses, et ces populations nous permettront d’étudier par évolution expérimentale le rôle de la recombinaison dans l’adaptation au stress salin au cours de générations sexuées. Enfin, sur la base des résultats précédents, nous développerons des modèles mathématiques pour prédire les profils de recombinaison en fonction de la séquence, ce qui nous permettra d’extrapoler nos observations sur les relations recombinaison-adaptation à une plus large gamme de situations. L’excellente complémentarité entre les méthodes, les ressources biologiques et les compétences des partenaires font de ce projet une occasion sans précédent d’élargir nos connaissances sur les causes et conséquences évolutives de la variation quantitative de la recombinaison, et de déchiffrer le rôle que joue la recombinaison dans l’adaptation au stress.

Les cellules cessent de migrer et de proliférer lorsque les cultures sont denses. Lors d’une réparation de blessure ou d’autres traitements mécaniques, les cellules reprennent la migration et la progression dans le cycle cellulaire. La coordination cellulaire dans les migrations collectives implique la mécanotransduction par le cytosquelette d’actine au niveau des jonctions cellules-cellules. Notre but est d'identifier de nouvelles protéines dans ce processus. Plusieurs candidats corrélés à la voie RAC1-WAVE-Arp2/3 (dependency maps) seront étudiés par perte de fonction et sauvetage dans les cellules MCF10A et les embryons de poisson-zèbre. Les phénotypes de coordination cellulaire seront analysés avec des outils et des concepts de physique (ablation laser, billes magnétiques, nématique active). En reconstituant in vitro des jonctions cellule-cellule, nos protéines candidates seront directement impliquées dans la mécanotransduction des forces du cytosquelette ou dans sa régulation.

Les structures recouvertes de clathrine (SRCs) régulent l’internalisation de récepteurs à la membrane plasmique mais j’ai montré qu’ils peuvent également pincer les fibres de collagène de l’environnement, aidant ainsi les cellules à adhérer et migrer dans des substrats 3D. Les SRCs sont sensibles aux variations de tension de membrane qui, trop forte, inhibe leur bourgeonnement. Cette tension est constamment challengée, notamment par des facteurs externes à la cellule comme des objets rencontrés sur son passage (ex : fibres de collagène) ce qui pourrait impacter la dynamique des SRCs sur les fibres et donc la migration. Les cavéoles sont d’autres invaginations de la membrane plasmique qui répondent à une augmentation soudaine de la tension en s’aplatissant dans la membrane plasmique, permettant ainsi de relâcher la tension. Mon hypothèse est que la régulation de la tension de membrane par les cavéoles régule la dynamique des SRCs sur les fibres et donc la migration des cellules.

Tous les organismes vivants sont capables de détecter des forces mécaniques telles que compressions, tensions ou cisaillements. La transduction de tels signaux mécaniques contribue aux modifications de la forme de la cellule et au destin cellulaire. Les voies associées à la mécanoperception commencent à être déchiffrées au cortex cellulaire, cependant les voies de mécanotransduction nucléaire, intégrant les propriétés mécaniques du noyau à l’expression génétique et au destin cellulaire, restent floues. Nos travaux, récemment publiés dans Current Biology, indiquent que des perturbations mécaniques physiologiques appliquées aux cellules du méristème racinaire de la plante modèle Arabidopsis modifient la forme, la rigidité et la compaction de la chromatine des noyaux ainsi que l'expression de gènes mécanosensibles. Les protéines GIP sont présentes à l'enveloppe nucléaire. Elles contrôlent la forme et la rigidité du noyau, la nucléation des microtubules et l'architecture des centromères. Les modifications dépendantes de GIP des propriétés rhéologiques du noyau peuvent également affecter le destin cellulaire. Sur la base de nos données, nous émettons l'hypothèse que, chez les plantes, l’enveloppe nucléaire intègre des signaux mécaniques périphériques pour contrôler les propriétés mécaniques du noyau, l'état de la chromatine et l'expression des gènes. Dans le projet Mecha-NUC, nous aborderons 2 questions principales chez les plantes : Quelles sont l'identité et la fonction de la voie de mécanotransduction nucléaire ? Et dans quelle mesure les changements qui en résultent dans les propriétés mécaniques du noyau affectent la chromatine, l'expression des gènes et la destinée cellulaire? Les questions que nous abordons sont inédites chez les plantes et ouvrent de nouvelles voies dans la compréhension de la mécanotransduction nucléaire chez les cellules possédant une paroi cellulaire à l’échelles cellulaire et tissulaire. En se focalisant sur les mécanismes de signalisation impliquant GIP et les microtubules, en relation avec des protéines du nucléosquelette spécifiques des plantes, nous décrypterons une nouvelle voie de mécanotransduction. Notre projet se situe à l’interface entre biologie cellulaire et biophysique. Il comprend des approches de micromécanique, de biologie moléculaire à l’échelle omique, ainsi que de l'imagerie in vivo à haute résolution et de la modélisation 3D informatique.

Dans les cellules végétales cyclantes, la préparation et l'exécution de la division cellulaire implique une série de modifications cytologiques concertées, coordonnées de façon dynamique et sous le contrôle du cycle cellulaire. Dans ce projet, nous proposons d'établir un cadre de référence spatio-temporel permettant d'intégrer l'information, d'identifier les étapes-clés, les acteurs et les régulations et de proposer un modèle cohérent et résolu dans le temps de la division végétale. Nous établirons une approche d'imagerie quantitative, dynamique et intégrative, prenant en compte une diversité d'acteurs comme le cytosquelette, le noyau, la membrane et la signalisation lipidique au cours du cycle cellulaire. Des outils de traitement et d'analyse d'image seront mis en place pour traiter, intégrer et exploiter la grande quantité d'images produites à différentes échelles de temps et d'espace. Cet effort sans précédent permettra d'aborder une variété de questions anciennes dans le domaine.

Les cardiopathies congénitales (CHD) représentent un tiers des anomalies congénitales graves. Les CHD définissent un large ensemble de déficits structurels et fonctionnels qui apparaissent au cours du développement, les formes les plus communes affectant la région conotruncale au pôle artériel qui forme la base myocardique de l’aorte et du tronc pulmonaire à la sortie des ventricules gauche et droit. La région conotruncale se forme à partir de la voie efférente du tube cardiaque (outflow tract : OFT) qui dérive des cellules progénitrices du second champ cardiaque (SHF) du mésoderme pharyngé. Le développement du SHF est régulé par un réseau complexe de facteurs de transcription et de voies de signalisation, dont la perturbation conduit à des formes communes de CHD. À ce jour, seulement 30% des CHD se sont avérées avoir une origine génétique. Des causes environnementales et leur interaction avec des causes génétiques deviennent évidentes. Différents facteurs environnementaux tels qu’un faible niveau d'oxygène, une carence en acide folique, un alcoolisme ou une obésité maternelle, ont un impact sur le développement conotruncal chez l’homme et des modèles animaux. Dans ce contexte, notre projet explorera la relation entre les causes génétiques et environnementales des CHD, en particulier l'obésité maternelle, en étudiant la contribution des évènements génétiques et environnementaux dans la régulation du métabolisme des cellules progénitrices du SHF lors de leur différenciation. Les résultats que nous avons obtenus démontrent que le facteur de transcription Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (Pparg) dont l’activité est induite par les acides gras est spécifiquement enrichi dans une sous-population de cellules du SHF lorsqu’elles se différencient dans l’OFT. De plus, des résultats préliminaires obtenus chez des embryons sauvages et mutants conditionnels démontrent d’une part que Pparg est requis dans le SHF pour le développement du tube cardiaque et d’autre part qu’une obésité maternelle induite augmente le risque de CHD. L'objectif du projet Pp-HEART repose sur ces résultats qui fournissent un nouveau point d'entrée pour les études des interactions génétiques et environnementales au cours du développement précoce du cœur. Nous proposons le senseur lipidique PPARg comme régulateur clé du métabolisme des cellules du SHF lors de leur différenciation et que l'obésité maternelle modifie le métabolisme du SHF occasionnant des CHD. Notre projet étudiera la régulation de Pparg dans les progéniteurs cardiaques, en utilisant des souris modèles et des approches expérimentales de pointe telles que la culture d'embryons/explants ex vivo, l'imagerie et l'ARN-Seq. Pp-HEART utilisera également des approches quantitatives de pointe telles que la respirométrie mitochondriale et l'analyse de flux en temps réel afin d’obtenir le premier profil métabolique des cellules du SHF en différenciation. Les études seront réalisées avec des embryons sauvages et des embryons obtenus de mères obèses induites par une alimentation riche en graisse. Ainsi, nous identifierons de nouvelles fonctions critiques de PPARg, des gènes régulateurs et des voies métaboliques indispensables au déploiement des cellules du SHF et à la morphogenèse cardiaque. Une force majeure de Pp-HEART est qu'il combine pour la première fois des domaines d'expertise complémentaires pour étudier le développement et le métabolisme énergétique ainsi que des modèles de souris uniques pour se concentrer sur un domaine inexploré du développement cardiaque précoce. Pp-HEART apportera de nouvelles connaissances sur l'étiologie des CHD en relation avec les facteurs de risques environnementaux tels que l'obésité maternelle et identifiera à terme des cibles pertinentes dans le diagnostic et la prévention des CHD potentiellement mortelles.

La phosphatidylsérine (PS) est inégalement répartie au sein de la cellule et est particulièrement enrichie dans le feuillet cytoplasmique de la membrane plasmique (MP). Cette distribution est essentielle au bon fonctionnement cellulaire. Cependant, le PS est synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RR) et sa distribution cellulaire asymétrique doit être activement maintenue par des protéines de transport dédiées. Nous avons étudié le transport du PS de l’ER vers la PM par la protéine de levure Osh6 dans les cellules (Copic) et in vitro (Drin) et sa bascule entre les feuillets membranaires (Lenoir). Cette proposition est basée sur notre récente découverte selon laquelle Osh6 interagit avec une protéine de liaison ER-PM, Ist2, qui est requise pour le transport du PS vers le PM. En plus d'une longue queue cytosolique dans laquelle nous avons identifié le site de liaison à Osh6, Ist2 contient un grand domaine trans-membranaire qui réside dans le RE. Il est intéressant de noter que ce domaine présente une homologie structurelle avec la famille de protéines de mammifère TMEM16, des scramblases lipidiques, ce qui suggère que Ist2 pourrait fonctionner comme une scramblase du PS. De cette façon, Ist2 pourrait coupler le contrôle de la distribution entre feuillets du PS au RE et son transfert ultérieur à la MP. En utilisant l'exemple Osh6-Ist2, nous posons des questions générales sur les avantages et les contraintes de l'attache du transporteur lipidique aux sites de contact avec la membrane. En combinant l'expertise de L. Monticelli dans les simulations de dynamique moléculaire avec des reconstitutions biochimiques et des approches cellulaires, nous explorerons l'activité de Ist2 dans la membrane ER et son couplage avec le transport PS médié par Osh6. Enfin, nous étudierons la régulation de Ist2 par phosphorylation et par le pH, compte tenu de l'abondance des résidus de sérine, thréonine et histidine dans sa queue cytosolique. Nous abordons ainsi, pour la première fois, le couplage entre le mouvement PS à l'intérieur et entre les membranes cellulaires.

Etude d'un second mode de migration collective Notre programme de recherche vise à étudier un nouveau mode de migration que nous avons nommé « collective amiboide ». La migration des cellules indépendantes s’exerce selon deux mécanismes distincts, suivant que la force est générée par adhésion/traction (mesenchymal) ou par friction/propulsion (amiboïde). A ce jour, un seul mode de migration collective n’a été décrit ; il repose sur l’adhésion des cellules à un substrat et la traction de la cohorte par des « leaders ». Nos résultats non publiés, obtenus à partir d’explants et de lignées cellulaires normales et tumorales, démontrent pour la première fois que des groupes de cellules peuvent migrer indépendamment de la formation d’adhésions focales. Les cohortes se propulsent dans des environnements non-adhérents grâce à la contractilité du cytosquelette d’acto-myosine. Ce programme de recherche vise caractériser ce second mode de migration collective en répondant aux questions suivantes : i) Existe t’il une polarité avant/arrière dans le groupe de cellules? ii) Comment la force est-elle générée et coordonnée dans ces cohortes ? iii) Les cohortes sont-elles hiérarchisées en cellules « leaders » et « followers »? iv) Les cohortes sont-elle « plastiques », alternant migration collective par traction et par propulsion ? quels en sont les déterminants ? v) Où et quand la migration collective amiboïde est-elle activée dans les processus physiologiques et pathologiques ? Notre consortium multidisciplinaire utilisera la modélisation, la micro-fabrication, l’optogénétique combinés à des approches de microscopie afin de résoudre ces questions. Basés sur de robustes résultats préliminaires, ce programme impactera la recherche fondamentale en décrivant un quatrième mode de migration cellulaire. Alors que la migration collective amiboide semble préférentiellement activée pas les cellules tumorales, nos résultats pourraient aussi être exploités en recherche biomédicale afin de cibler la dissémination métastatique des cancers.

Le microbiome intestinal est fondamental pour la santé. Son alteration est impliquée dans de nombreuses maladies, y compris les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), pour lesquelles il existe un grand besoin médical non satisfait. Le tryptophane (Trp) est un acide aminé essentiel. Il constitue également un précurseur biochimique des métabolites qui ont des effets majeurs sur la physiologie. La voie de la kynurénine (KP) est l’une des voies du métabolisme du Trp dans le tractus gastro-intestinal et dépend de l’indoleamine 2,3-dioxygénase (IDO) 1, qui est exprimée à la fois dans les cellules immunitaires et épithéliales. Le KP est modulé par le microbiome intestinal et est sur-activé dans les MICI. Ici, nous allons (i) explorer le rôle de métabolites spécifiques du Trp, en aval de IDO1, sur l'inflammation intestinale; (ii) développer une stratégie thérapeutique basée sur la modulation du KP et (iii) évaluer le rôle des métabolites de Trp en tant que biomarqueurs dans les MICI.

L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie mortelle et énigmatique affectant l’arbre vasculaire pulmonaire avec d'importants besoins médicaux non satisfaits. L'HTAP se caractérise par une pan-vasculopathie complexe impliquant une prolifération excessive et une dysfonction de plusieurs types cellulaires, ainsi que par une inflammation et une fibrose de la vascularisation pulmonaire, conduisant à une augmentation de la pression artérielle pulmonaire qui évolue vers l’insuffisance cardiaque droite. L’HTAP peut être idiopathiques ou héréditaires. Les mutations du gène BMPR2 sont à l’origine de la plupart des formes héritables de cette maladie. Récemment, notre groupe et d'autres avons démontré que la perturbation du métabolisme cellulaire ainsi que la rigidification de la matrice extracellulaire (MEC) périvasculaire favorisent le développement de l’HTAP. En réponse à des stress hormonaux, inflammatoires et environnementaux tels que l'hypoxie/l'ischémie ou l’étirement pariétal des artères, les fibroblastes adventitiels de l'artère pulmonaire (FAAPs) sont les premières cellules vasculaires à présenter des signes d'activation. Les FAAP activés sont responsables d’un dépôt périvasculaire de collagène et d’un remodelage actif de la MEC - autant de processus qui nécessitent de l'énergie. Pourtant, on ne sait pas si et comment la reprogrammation du métabolisme des cellules vasculaires répond aux besoins métaboliques des FAAPs activés et affecte le remodelage de la MEC. Les manifestations des symptômes, y compris l'essoufflement et l'insuffisance cardiaque droite, arrivent souvent tardivement au cours de l’HTAP. Par conséquent, le délai entre le diagnostic et l’issue de la maladie est court, et les échantillons pulmonaires pertinents pour l’étude de l'HTAP ne peuvent être obtenus qu’au stade terminal de son évolution, c’est-à-dire au décès du patient ou après la transplantation pulmonaire. Cela limite intrinsèquement notre capacité à obtenir une signature moléculaire de la maladie à des moments déterminants, tels que son initiation et les étapes de son développement. Pour mieux comprendre la physiopathologie de l’HTAP, des modèles animaux ont été développés. En dépit des efforts déployés, aucun d’eux ne mime parfaitement l'HTAP. De plus, ils offrent un accès limité à l'évolution de la maladie. Pour saisir les bases moléculaires de la pathologie, nous avons développé les premiers rats mutés pour le gène Bmpr2. De façon remarquable, ces rats reproduisent des dysfonctionnements cellulaires et moléculaires majeurs décrits dans l'HTAP. Peut-être plus important encore, ces rats développent un HTAP progressive dont la pénétrance augmente au cours du temps. Ce modèle unique permet ainsi des études moléculaires et cellulaires propre à définir les déterminants de l'évolution de l’HTAP. Nous proposons donc de tirer profit de la disponibilité unique au sein de notre partenariat, de cellules primaires isolées de patients atteints d’HTP/HTAP, de modèles de rongeurs d’HTP dans lesquels nous avons une grande expertise et d’échantillons biologiques humains présents dans une grande biobanque de plasma et de tissus pour comprendre la relation causale entre l'activation des FAAPs, leur métabolisme et le remodelage et la rigidification de la MEC périvasculaire au cours de l'évolution de l’HTP. Grâce à une combinaison d'approches transdisciplinaires incluant la biologie moléculaire, la métabolomique, la bioinformatique et des modèles précliniques, nous proposons de dévoiler le fondement moléculaire du remodelage de la MEC dans l’HTAP. Au final, déchiffrer la relation causale entre le métabolisme des FAAPs activés et la synthèse du collagène, ainsi que révéler le circuit moléculaire qui contrôle la reprogrammation du métabolisme des FAAPs, fournira donc des informations essentielles sur l'origine moléculaire de l’HTAP, identifiant ainsi des stratégies thérapeutiques innovantes et jamais envisagées centrées sur le métabolisme des FAAPs.

Le syndrome de Shwachman-Diamond (SDS) et les neutropénies congénitales (NC) SDS-like liées à une anomalie du complexe SRP (signal recognition particle) sont caractérisées par un défaut de maturation de la lignée granuleuse et une apoptose des granulocytes neutrophiles et de leurs précurseurs. Ces pathologies sont dues à des altérations génétiques de SBDS, SRP54 et SRP68 affectant respectivement la maturation des ribosomes et l’adressage des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE). Une fonction clé des neutrophiles est la synthèse de protéines avec un rôle anti-infectieux qui sont empaquetées dans des granules. Les ribosomes et le RE ont un rôle majeur dès le stade promyélocytaire de la granulopoièse au cours duquel débute la synthèse des granules. Des altérations de l’axe ribosome/RE peuvent conduire à des défauts de synthèse, d’adressage, de maturation et de conformation des protéines. Nos résultats préliminaires et récemment publiés sur SBDS, SRP54 et SRP68 ont mis en évidence un stress accru du RE, une activation de l'UPR et une apoptose P53-dépendante des cellules granulocytaires. Le projet vise trois objectifs: 1) étudier l’impact des anomalies de SBDS et de SRP sur l’homeostasie du RE à chaque étape de la différenciation granulocytaire et tester des inhibiteurs du stress du RE, 2) caractériser les mécanismes moléculaires responsables du stress du RE et identifier les protéines affectées par un défaut de SBDS ou du complexe SRP et, 3) identifier de nouvelles entités génétiques de NC SRP-like. Le projet est divisé en 3 workpackages scientifiques (WP). Dans le premier WP, nous analyserons la viabilité cellulaire, le cycle cellulaire, la sénescence et l’apoptose, en particulier dépendante de P53, à chaque étape de la granulopoïèse à partir de cellules primaires de patients et de shARN. Nous étudierons au niveau transcriptionel et protéique les mécanismes d’induction du stress du RE au cours de la granulopoièse. Nous réaliserons des tests in vitro avec des molécules chaperones restaurant l'homéostasie protéique. Enfin, les patients avec un SDS et une NC lié à un défaut du complexe SRP, pouvant présenter une anémie et/ou une thrombopénie, nous étudierons également les lignées érythrocytaire et mégacaryocytaire. Dans le second WP, nous utiliserons trois approches complémentaires pour disséquer les mécanismes moléculaires du stress du RE induit par les mutations SBDS et SRP. Nous réaliserons des transcriptomes à l’échelon unicellulaire dans les progéniteurs granulocytaires en utilisant une technologie innovante combinant le scRNA-seq et le CITE-seq. Nous ferons du profilage des ARN ribosomaux pour déterminer les anomalies des pauses ribosomales connues pour affecter la dégradation co-traductionnelle de l’ARNm et de la chaîne naissante. Enfin, nous ferons de la protéomique pour savoir quelles protéines sont dérégulées ou mal transloquées dans le ER. Dans le troisième WP, nous réaliserons le séquençage génome complet couplé au séquençage ARN afin de rechercher de nouvelles entités génétiques parmi les 30% de NC restant sans étiologie moléculaire. Le projet inclut deux équipes, qui ont une expertise importante et complémentaire dans l’étude de l’hématopoïèse, du stress du RE, des analyses RNAseq sur cellule unique et de génomique. Le projet s'appuiera également sur le registre français des NC qui effectue un recueil exhaustif des données cliniques en relation avec une biobanque centralisée et, sur la collaboration avec deux équipes de recherche avec une expertise d’une part sur l’étude du stress du RE et d’autre part, sur le profilage ribosomique. En conclusion, nous devrions considérablement améliorer nos connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables du stress du RE et de l’activation de l’UPR dans la granulopoïèse et sur les protéines affectées dans le SDS et les NC liées à SRP. L'identification de nouveaux gènes pourrait révéler de nouvelles voies physiopathologiques impliquées dans les NC.

L'homéostasie du sodium et de l'eau sont contrôlées par l'aldostérone et son récepteur, le Récepteur Minéralocorticoïde (MR), un facteur de transcription régulant l'expression de gènes cibles impliqués dans la réabsorption du sodium, notamment au niveau rénal. Nous avons récemment identifié une fenêtre temporelle spécifique au cours du développement rénal au cours de laquelle cette voie de signalisation est inefficace en raison d’une baisse de l’expression rénale du MR pendant la période périnatale contrairement à d’autres tissus cibles, comme le poumon, où l'expression du MR est constante. Cependant, l'activation de cette voie de signalisation est critique, particulièrement après les premiers jours de vie, afin de maintenir une balance sodée positive, comme cela a été démontré chez les nourrissons prématurés. Ces nouveau-nés fragiles ont une perte sodée prolongée en période postnatale et peuvent développer une hypertension artérielle précoce à l'âge adulte. Des données obtenues par notre équipe, sur un modèle murin de prématurité élaboré au laboratoire, mettent en évidence une baisse persistante de l'expression rénale du MR en période postnatale et ce, jusqu’à l’âge adulte. De façon intéressante, ces souriceaux anciens prématurés développement une hypertension artérielle à l’âge adulte. Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant l'expression du MR au cours du développement rénal restent inconnus à ce jour. Notre équipe a récemment montré que l'expression rénale du MR est régulée chez l’adulte par des mécanismes post-transcriptionnels impliquant des protéines de liaison à l'ARN, comme Tis11b ou HuR, et des microARNs (miARNs) qui modulent la stabilité du transcrit MR. Parmi les miARNs candidats identifiés, quatre (miR-324-5p, 491-5p, 30c-2-3p, 7003-5p) ont été caractérisés récemment par notre équipe comme interagissant fonctionnellement avec la région 3'-non traduite (3'-UTR) du transcrit MR avec une diminution de l'activité luciférase sous contrôle de la région 3'-UTR du MR. Ainsi, notre objectif vise à évaluer le rôle de Tis11b, HuR et de ces miARNs candidats dans la régulation de l'expression du MR au cours de la période périnatale et ses conséquences sur l'activation de la voie de signalisation minéralocorticoïde en physiologie et en situation de prématurité. Notre projet a trois objectifs principaux : 1) Étudier si Tis11b, HuR ou les miARNs identifiés sont des régulateurs post-transcriptionnels de l'expression rénale du MR au cours de la période périnatale et si cette régulation est tissu-spécifique par comparaison au poumon 2) Evaluer si ces mécanismes régulateurs sont modifiés dans des situations pathologiques comme la prématurité 3) Examiner si l'expression de ces miARNs pourrait être mesurée chez les nouveau-nés prématurés et pourrait être pertinente au regard de la perte de sodium, afin de déterminer s’ils pourraient représenter de nouveaux biomarqueurs précoces, non-invasifs de cette perte sodée et ainsi permettre une approche thérapeutique personnalisée pour chaque nouveau-né prématuré. Afin d’explorer ces mécanismes régulateurs, nous utiliserons plusieurs approches complémentaires : 1) in vitro : des cultures organotypiques de reins et de poumons de souris sauvages et du modèle murin de prématurité 2) in vivo : un modèle murin de prématurité 3) des études translationnelles chez les nouveau-nés prématurés humains. Ce projet ambitieux sera mené par une jeune chercheuse qui a acquis une expertise dans le domaine de la signalisation minéralocorticoïde en période périnatale et qui a mené des projets de recherche fondamentale et translationnelle sur ce sujet, au sein d'une équipe expérimentée et compétente. Une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires contrôlant l'expression du MR en période périnatale aura incontestablement un impact majeur sur la prise en charge des enfants prématurés et permettra potentiellement de prévenir l'émergence à l'âge adulte de maladies telles que l'hypertension artérielle.

Comprendre comment l'exposition aux rayonnements ionisants (IR) induit un vieillissement prématuré et installe un état pré-leucémique est un problème majeur de santé publique. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) génèrent toutes les cellules du sang. Le maintien de leur intégrité est donc crucial. Les CSH sont particulièrement sensibles aux IR, utilisées notamment lors des radiothérapies. L’IR induit des défauts similaires à l’âge dans les CSH : l'accumulation de dommages à l'ADN, la perte d'auto-renouvellement et une différenciation biaisée vers la lignée myéloïde conduisant à une augmentation du nombre de cellules myéloïdes et à un déclin de la réponse immunitaire adaptative. Ceci contribue probablement au développement de pathologies liées à l’âge et au risque élevé de développer des néoplasmes myéloïdes suite aux thérapies (t-NM). Les t-NM sont associés à un taux de survie très faible et constituent l'une des conséquences les plus dévastatrices des traitements anti-cancéreux. C’est devenu une préoccupation majeure au cours des dernières années, car le nombre de survivants des traitements anticancéreux ne cesse d'augmenter, accroissant l'incidence des t-NM. Cependant, les mécanismes régissant la perte de fonction des CSH suite aux IR sont inconnus. L'IR induit des cassures double brin (CDB) de l’ADN. Il est généralement admis que les lésions de l'ADN sont à l’origine du vieillissement. Cependant, un lien direct entre CDB et perte de fonction des CSH n’a pas été établi. D'autre part, il a été démontré que l'IR induit des altérations épigénétiques dans différents tissus. Les facteurs épigénétiques sont des régulateurs clés de la fonction des CSH et sont souvent mutés dans les leucémies. Ces mutations augmentent également avec l'âge chez des individus en bonne santé, où elles confèrent une hématopoïèse clonale. Les défauts épigénétiques pourraient donc être à l’origine de la perte de fonction des CSH et du développement des leucémies. Des altérations de l'hétérochromatine, qui réprime l'expression des éléments rétrotransposables (RTE), ont été rapporté au cours de l’âge. Les RTE sont des séquences répétées qui peuvent se propager dans le génome par un mécanisme de copier/coller. Ils constituent une grande source d'instabilité génomique. L'expression incontrôlée des RTE est également impliquée dans des altérations majeures du transciptome. Récemment, nous avons montré que les RTE sont surexprimés suite aux IR. L'équipe a également montré que l'expression des RTE augmente avec l'âge dans les CSH murines et humaines. Cependant, l'impact de la dérépression de RTE sur le transcriptome et la fonction des CSH est inconnu. Nous proposons d'explorer l’hypothèse selon laquelle l'IR affecterait directement l'hétérochromatine des CSH. Les altérations de l'hétérochromatine, en libérant des RTE, modifieraient le transcriptome et seraient à l’origine de la perte de fonction des CSH et de l'établissement d'un état préleucémique. Les mutations perte de fonction du gène Tet2 font partie des mutations les plus fréquentes lors du vieillissement, dans l'hématopoïèse clonale, ou dans les leucémies, et sont associées à un risque accru de t-NM. Nous proposons également d'étudier l’impact de la perte de fonction de TET2 sur l’hétérochromatine des CSH et l’expression des RTE. Nous étudierons enfin l'hypothèse selon laquelle les altérations de l'hétérochromatine induites par l'IR et la perte de fonction de TET2 pourraient coopérer pour déréguler de façon synergique des gènes et/ou RTE communs et/ou différents, augmentant et accélérant le risque de développer des t-NM. Ce projet de recherche devrait fournir de nouvelles pistes sur les mécanismes impliqués dans la perte de fonction des CSH lors de l'IR ou du vieillissement, et le développement des t-NM. L'objectif final de ce projet est l’identification de voies pouvant être ciblées sur le plan thérapeutique pour atténuer les effets des thérapies génotoxiques et du vieillissement.

Chez les mammifères, cellules germinales (CG) et acide rétinoïque (ATRA) sont les clés du succès de la reproduction sexuée. L’ATRA, requis à une étape cruciale de la différenciation des CG mâles, a longtemps été cité à tort comme l’inducteur de l’entrée en méiose dans l’ovaire. Les travaux récents des 4 équipes partenaires du projet ARDIGERM ont brisé ce dogme, tout en révélant des rôles fondamentaux de l’ATRA d’une part dans la prolifération des CG fœtales, qui conditionne la réserve de follicules ovariens, et d’autre part dans l’achèvement du processus méiotique dont dépend la production de gamètes haploïdes génétiquement équilibrés. Ils mettent par ailleurs en exergue l’existence d’un facteur testiculaire inhibant l’entrée en méiose, dépendant de CYP26B1 mais différent de l’ATRA. Le projet ARDIGERM a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces nouvelles fonctions de l’ATRA et d’identifier le facteur inhibiteur de la méiose chez 3 espèces, dont l’Homme.

L’objectif du projet est de développer des outils thérapeutiques contre le diabète basés sur l’utilisation de bactéries intestinales produisant naturellement le métabolite 4-crésol, que nous avons trouvé négativement associé au diabète de type 2 chez l’Homme et qui, à faible dose, a des effets bénéfiques sur le diabète, l'obésité et la stéatose hépatique chez des modèles précliniques de diabète et d'obésité. L’expertise complémentaire des partenaires en physiologie dans les systèmes modèles et en microbiologie permettra de sélectionner ou modifier des bactéries pour leur capacité à produire le 4-crésol, qui seront inoculées dans des modèles précliniques de diabète de type 2 et d'obésité afin de tester l’effet thérapeutique de l'enrichissement intestinal de ces bactéries sur la sévérité and la transmission de phénotypes représentatifs du diabète. Une analyse phénotypique détaillée des modèles animaux fournira des informations sur des modifications de tolérance au glucose, de sécrétion d’insuline, de sensibilité à l’insuline, d’inflammation et de stéatose hépatique consécutifs à l’inoculation de bactéries productrices de 4-cresol. Cette recherche, qui se fonde sur le concept de communication entre microbiote intestinal et physiologie de l’hôte, et son rôle dans le diabète, conduira à des applications cliniques et de nouvelles solutions thérapeutiques pour réduire l'hyperglycémie par stimulation de l'insulinosécrétion induite par le crésol délivré par le microbiote intestinal.

La reproduction saisonnière est une réponse adaptative cruciale pour faire face aux changements environnementaux annuels. Afin de permettre la naissance des petits aux printemps, les espèces se reproduisent durant le printemps (gestation courte, hamster) ou durant l’automne (gestation longue, mouton). Nos travaux ont identifié un rôle important pour deux peptides hypothalamiques dans le contrôle de la saisonnalité: RFRP3 (RF-amide Related Peptide 3) et KISS1 (Kisspeptin). Le rôle de RFRP3 demeure énigmatique mais nos résultats suggèrent qu’il joue un rôle clé dans la régulation temporelle de la saisonnalité, probablement via KISS1. Nous allons donc invalider ce gène chez le mouton et le hamster, définir l’ensemble des gènes exprimés par les neurones RFRP3 ainsi que les relations entre neurones RFRP3 et KISS1. Ces études clarifieront le rôle potentiel de RFRP3 dans le circuit qui régule la reproduction saisonnière.

Nos résultats préliminaires indiquent que la cytotoxicité liée au pneumocoque (PN), agent étiologique majeur de la méningite bactérienne, ainsi qu'à la pneumolysine (Ply), son principal facteur de virulence, implique la signalisation calcique régulée par les connexines (Cxs) composants les jonctions Gap intercellulaires. Dans un modèle murin d'infection, l'expression de la Cx43 astrogliale favorise la translocation de la PN dans le cerveau et la méningite. Nous avons également constaté que des facteurs sécrétés indépendants de Ply (PSFs) sont associés à la méningite à PN et déclenchent une signalisation calcique et la cytotoxicité des cellules endothéliales. Le but de ce projet est de caractériser ces PSFs, ainsi que leur rôle et celui de Ply dans la signalisation dépendante des Cxs et du Ca2+ à l’aide d’un modèle unique de barrière hémato-encéphalique (BHE) reconstitué in vitro. Le rôle des PSFs dans le franchissement de la BHE sera caractérisé dans le modèle de méningite murine à PN.

L'incidence de Clostridioides difficile a triplé au cours des 15 dernières années et cette bactérie est devenue le principal agent causal des diarrhées associées aux antibiotiques et aux soins hospitaliers. L'impact des infections à C. difficile (ICD) dans les hôpitaux est considérable en terme de mortalité, de morbidité mais aussi du cout généré par ces infections. Les souches virulentes de C. difficile produisent généralement deux toxines qui ont été identifiées comme les principaux facteurs de virulence. Cependant, le mécanisme de libération des toxines est encore mal compris. Les ICD sont difficile à prévenir et à traiter car ce pathogène est résistant à de nombreux agents antimicrobiens. Bien que la résistance de C. difficile aux ß-lactamines, la classe d'antibiotiques la plus couramment prescrite, soit l'un des principaux facteurs contribuant au développement des ICD, les mécanismes sous-jacents de la résistance sont actuellement inconnus. En raison de la nature insatisfaisante des thérapies actuelles pour les ICD, un impératif actuel est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance aux antibiotiques et dans le contrôle des étapes clés des ICD dans la perspective de développer de nouvelles thérapies préventives et curatives. . Chez C. difficile, la majorité des ponts interpeptidiques du peptidoglycane (PG) est synthétisée par des transpeptidases atypiques, les L,D-transpeptidases (LDTs), insensibles à l'inhibition par la plupart des antibiotiques de type ß-lactamines. Notre hypothèse est que les LDT sont des enzymes clés pour la biosynthèse du PG qui conférent la résistance au ß-lactamines et jouent un rôle crucial dans la libération de toxines chez C. difficile. Le but global de ce projet est donc de caractériser les trois LDT de C. difficile et leur role respectif. Notre premier objectif sera d'élucider les fonctions des LDT dans la biologie de la paroi cellulaire de C. difficile. Nous étudierons les rôles relatifs des voies inhabituelles de L,D-transpeptidation et des voies classiques de D,D-transpeptidation dans la formation des liaisons interpeptidiques pendant l'expansion et la maturation du PG de C. difficile. Nous déterminerons également dans quelle mesure les LDT sont importantes pour la morphologie cellulaire et la résistance aux ß-lactamines. Grâce à l'utilisation d'une approche génomique globale, notre second objectif sera d'identifier de nouveaux gènes régulant la voie de L,D-transpeptidation. Un sous-ensemble de ces gènes sera sélectionné pour une caractérisation plus approfondie. La libération de toxines de C. difficile repose sur des enzymes de degradation du PG, dont l'activité est contrôlée par des modifications structurelles du PG. Notre troisième objectif sera donc d'évaluer l'impact des LDTs sur la libération des toxines in vitro et sur la virulence in vivo. Nous identifierons également les acteurs moléculaires impliqués dans la libération des toxines chez C. difficile. Globalement, ces travaux fourniront des connaissances fondamentales sur la biosynthèse du PG de C. difficile, un domaine de recherche encore négligé chez cette bactérie. Étant donné que la synthèse de la paroi cellulaire est l'une des cibles antibiotiques les plus importantes, une meilleure compréhension de la biologie de la paroi cellulaire de C. difficile pourrait aider à mettre au point des procédures pour surmonter la résistance aux antibiotiques de cette bactérie et à identifier de nouvelles cibles médicamenteuses pour l'éradication spécifique de C. difficile. A terme, les principes fondamentaux issus de ce travail auront des implications plus larges que la recherche sur C. difficile et amélioreront considérablement notre compréhension actuelle du contrôle et de la dynamique de la biosynthèse du PG.

Au cours de leur co-évolution avec leurs hôtes, les pathogènes bactériens ont développé une variété impressionnante de stratégies pour prendre le contrôle des voies cellulaires et éviter les mécanismes de défense de l'hôte afin d'établir une infection productive. Parmi la gamme d'outils dédiés à la manipulation de l'hôte, les bactéries intracellulaires pathogènes emploient des protéines effectrices qui sont sécrétées dans le cytoplasme pendant l'infection. Ces effecteurs bactériens se localisent dans des compartiments cellulaires spécifiques, où ils exercent leur fonction principalement en modifiant les protéines eucaryotes, en remodelant les organelles cellulaires ou en détournant les voies de signalisation. Au cours de la dernière décennie, plusieurs mécanismes d'action ont été décrits pour les effecteurs bactériens sécrétés, allant de la suppression immunitaire innée, l'évasion de l'autophagie, l'inhibition de l'apoptose, la subversion du trafic membranaire et la manipulation de la dynamique du cytosquelette. Cependant, il a été démontré que la majorité des facteurs de virulence décrits à ce jour ciblent les protéines eucaryotes. En revanche, le ciblage direct des acides nucléiques de l'hôte reste peu exploré et se concentre principalement sur l'ADN. Alors que le ciblage de l'ARN serait également, pour une bactérie pathogène, un mécanisme important pour contrôler un large spectre de processus cellulaires, des effecteurs bactériens capables d'interagir avec des ARNs de l'hôte n'ont pas encore été identifiés. Notre projet entend combler cette lacune, en nous focalisant sur le pathogène Listeria monocytogenes, chez lequel nous avons identifié deux protéines ciblant de noyau (des nucléomodulines) et avons acquis des données solides suggérant qu'elles interagissent avec des ARNs eucaryotes, ainsi qu'avec la machinerie d'épissage alternatif des ARNs. L. monocytogenes est un agent pathogène humain cliniquement important, transmis par l'alimentation, qui peut entraîner une septicémie, une encéphalite ou une méningite grave chez les personnes immunodéprimées et des avortements chez les femmes enceintes. Parmi les protéines impliquées dans la pathogénie de L. monocytogenes, nous avons récemment identifié Zea, la première protéine bactérienne sécrétée identifiée comme se liant à l'ARN (RBP). Zea se lie à l'ARN de L. monocytogenes et stimule la réponse de l'interféron de type I pendant l'infection. Nous avons observé qu'au cours de l'infection, Zea se localise au niveau du noyau et se trouve enrichie au niveau des "speckles" nucléaires, les sites où s'accumulent les facteur de la machinerie d'épissage. Des expériences d'immunoprécipitation ont révélé que Zea se lie aux facteurs d'épissage de manière dépendante de l'ARN. Nous avons également identifié un autre effecteur de Listeria se liant à des facteurs d'épissage, et potentiellement à des ARNs, LntB. Ces résultats suggèrent qu'en sécrétant des RBP, Listeria peut cibler l'ARN de mammifère et affecter l'expression des gènes de l'hôte. Notre programme de recherche comprend l'identification des cibles ARN de Zea et LntB, la caractérisation de leur interaction avec des facteurs d'épissage, et la détermination du rôle fonctionnel de ces interactions dans l'expression de gènes de défense de l'hôte et dans la pathogénèse de L. monocytogenes. Par ailleurs, en appliquant la méthode de capture de l'interactome, nous prévoyons d'identifier de nouveaux effecteurs sécrétés par L. monocytogenes, se liant à l'ARN. Ce projet mettra en évidence une stratégie encore non caractérisée utilisée par un pathogène bactérien pour subvertir son hôte, c'est-à-dire par la sécrétion d'effecteurs de liaison à l'ARN. Nous prévoyons que ce projet ambitieux aura un impact de grande ampleur, dans plusieurs domaines de recherche comprenant la biologie des infections, la microbiologie fondamentale et la biologie cellulaire fondamentale.

Les cellules T invariantes associées aux muqueuses (MAIT) représentent un sous-type de lymphocytes très abondant chez l'homme avec une spécificité unique pour des métabolites microbiens. La conservation des cellules MAIT au cours de l'évolution indique des fonctions importantes et non redondantes. Malgré des fréquences et un phénotype modifiés dans plusieurs maladies infectieuses et non infectieuses, les fonctions des cellules MAIT restent mal connues. Contrairement aux cellules T CD4+ ou CD8+conventionnel, les cellules MAIT se différencient en cellules effectrices au cours du développement thymique. La façon dont le programme de différenciation acquis dans le thymus est modifié par les signaux tissulaires et environnementaux pour déterminer les fonctions et le positionnement des cellules MAIT dans les tissus n'est pas connue. Nos données préliminaires sont en faveur d'une nouvelle fonction pour les lymphocytes MAIT qui favoriserait la réparation des tissus au cours de la cicatrisation des plaies cutanées. Dans ce projet, nous évaluerons comment le programme de différenciation acquis dans le thymus est modifié par des signaux tissulaires et environnementaux pour conduire au positionnement et aux fonctions effectrices particulières des cellules MAIT cutanées. Cela fournira les données pour déterminer comment les cellules MAIT améliorent la cicatrisation cutanée en utilisant des outils génétiques, des expériences gnotobiotiques et de nouveaux composés chimiques. Les trois objectifs de ce projet sont d'étudier : 1. Comment le programme de différenciation des cellules MAIT intra-thymique interagit avec des signaux tissulaires et microbiens dans la peau en l'absence de manipulation expérimentale : quels sont les gènes ou facteurs de transcription impliqués dans l'orientation MAIT1 ou MAIT17, et dans le ciblage / rétention dans la peau ? Quels sont les intégrines / chimiokines ou autres médiateurs impliqués dans le positionnement du MAIT dans la peau ? Quel est le rôle du ligand et des bactéries ainsi que de l'expression de MR1 dans le ciblage et le maintien des sous-populations de MAIT dans la peau ? Ces données fourniront les cibles à manipuler génétiquement afin de modifier les propriétés des cellules MAIT dans les objectifs suivants pour déchiffrer les mécanismes impliqués dans l'effet protecteur des cellules MAIT pendant la cicatrisation des plaies cutanées. 2. Les fonctions effectrices des cellules MAIT responsables de l'effet favorable des cellules MAIT pendant la cicatrisation cutanée : l'effet protecteur est-il médié directement par les cellules MAIT ou par le recrutement d'autres types cellulaires ? Quels sont les médiateurs sécrétés ou exprimés par les cellules MAIT ? Quelles sous-populations de cellules MAIT sont impliqués ? Quand et à quel endroit les modules effecteurs fonctionnels de réparation tissulaire sont exprimés par les cellules MAIT au cours des différentes phases de cicatrisation cutanée ? 3. La façon dont les fonctions protectrices des cellules MAIT sont déclenchées pendant la cicatrisation des plaies cutanées : les cellules MAIT sont-elles activées par des signaux TCR / antigène ou des lymphokines ? Les cellules MAIT sont-elles recrutées ou prolifèrent-elles in situ lors de la réparation tissulaire ? L'activation ou l'inhibition des MAIT est-elle bénéfique ou délétère pendant la cicatrisation d'une plaie cutanée ? Nous testerons également le potentiel thérapeutique de l'activation des cellules MAIT chez l'homme.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative sans traitement curatif. Un défi majeur est de retarder l’âge d'apparition des symptômes et de ralentir la progression de la MH. Comme le cholestérol plasmatique ne peut pas traverser la barrière hémato-encéphalique, la synthèse du cholestérol dans le cerveau est principalement réalisée dans les astrocytes, alors que le cholestérol est catabolisé dans les neurones par l'enzyme cholestérol 24-hydroxylase (CYP46A1), conduisant à la conversion du cholestérol en 24 (S)-hydroxycholestérol (24S-OHC). Au début de la maladie, les niveaux de 24S-OHC sont réduits dans le plasma des patients atteints de la MH, parallèlement à une atrophie du noyau caudé. Le coordinateur de STERO-HD a montré que l'expression de CYP46A1 est fortement réduite dans le putamen des patients atteints de la MH et dans le striatum des modèles de souris transgéniques (R6/2) et knock-in (zQ175). La restauration de CYP46A1 par thérapie génique dans les neurones striataux est neuroprotectrice chez ces deux modèles de souris MH car cette approche rétablit directement l'ensemble de la voie du métabolisme du cholestérol, y compris la production de stérols (lanostérol et desmostérol) et de 24S-OHC. De façon intéressante, cette approche améliore la clairance des agrégats de Huntingtin mutée (mHTT) et, plus important encore, normalise le transcriptome , en particulier pour l'expression des gènes impliqués dans la transmission synaptique et l'activité du protéasome. Comme le 24S-OHC se lie aux récepteurs X du foie (LXR), une famille de récepteurs nucléaires importants régulant l'homéostasie du cholestérol, STERO-HD émet l'hypothèse que la neuroprotection de CYP46A1 implique l'activation des LXR dans les neurones et/ou les astrocytes. Cette hypothèse est étayée par un ensemble de données préliminaires : i) les astrocytes réactifs contribuent à la protection induite par CYP46A1 ; ii) l'expression des gènes cibles LXR est induite par CYP46A1 chez les souris knock-in MH (zQ175), et iii) des agonistes LXR sont neuroprotecteurs dans des cultures primaires de neurones striataux MH. A partir de ces données, STERO-HD va 1) disséquer les mécanismes spécifiques dans les neurones et les astrocytes qui assurent une régulation appropriée du métabolisme du cholestérol et qui sous-tendent la neuroprotection de CYP46A1 2) tester la neuroprotection induite par les agonistes LXR dans deux modèles de souris MH, fournissant ainsi la base de futurs essais cliniques 3) caractériser les mécanismes compensatoires spécifiques aux neurones et astrocytes qui sont impliqués dans la neuroprotection induite par CYP46A1 et les stérols dans des lignées humaines MH d'iPSC (induced Pluripotent Stem Cells) différenciées en neurones et astrocytes. L'innovation de STERO-HD vient de l'hypothèse selon laquelle la compensation cellulaire est améliorée en activant le métabolisme du cholestérol par de petites molécules telles que les stérols et une nouvelle classe d'agonistes LXR synthétiques. STERO-HD identifiera les petites molécules qui pourront être proposées dans le cadre d'essai clinique afin de retarder l'apparition de la MH et/ou ralentir la progression de la maladie. L'impact de CYP46A1 sur les mécanismes de compensation du stress comme le flux autophagique et la réparation des dommages à l’ADN sur des iPSC MH humains sera étudié. L'ambition finale du projet est le développement de nouvelles petites molécules à visée thérapeutique. Sachant que CYP46A1 est aussi bénéfique chez les souris atteintes de la maladie d'Alzheimer (MA), les résultats obtenus dans le cadre du projet STERO-HD pourrait également ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour la MA.

La découverte des effets antidépresseurs rapides de la kétamine a changé notre compréhension des troubles dépressifs majeurs et éveillé l’espoir de nouveaux traitements à efficacité accélérée. En effet, alors que les antidépresseurs classiques mettent plusieurs semaines à agir et sont inefficaces chez plus de 30% des patients, l’injection d’une seule dose de kétamine provoque des effets antidépresseurs rapides et robustes chez les patients atteints de dépression pharmaco-résistante. Malheureusement, de multiples aspects du mode d’action de la kétamine restent énigmatiques et son utilisation clinique est limitée par de sévères effets secondaires psychomimétiques. Mieux comprendre les mécanismes à l’origine du pouvoir antidépresseur de la kétamine et de ses propriétés psychomimétiques est donc une étape clé pour identifier de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement des troubles dépressifs majeurs. Utilisée depuis plus de cinquante ans comme anesthésique, la kétamine exerce son action sédative en bloquant les récepteurs du glutamate de type NMDA (RNMDA), des acteurs majeurs du neuro-développement, de la plasticité cérébrale et des fonctions cognitives. On a donc logiquement pensé que ses propriétés psychoactives reposaient également sur l’inhibition de ces récepteurs. Néanmoins, malgré de nombreux efforts pour développer des antagonistes alternatifs des RNMDA conservant l’efficacité antidépresseur de la kétamine sans présenter son caractère psychomimétique, aucune des drogues testées n’a égalé son potentiel thérapeutique et de nombreuses études récentes suggèrent que ses propriétés psychoactives pourraient reposer sur d’autres mécanismes. Au-delà de l’inhibition des récepteurs, nous proposons que la kétamine modifie rapidement l’organisation des RNMDA aux synapses et soulage ainsi les symptômes de la dépression en modulant la plasticité et le câblage des réseaux cortico-mésolimbiques contrôlant l’humeur. Pour tester cette hypothèse, nous étudierons les mécanismes d’action de la kétamine à l’échelle de la molécule unique. En combinant microscopie de super-résolution, électrophysiologie et biochimie, nous caractériserons l’impact de la kétamine, de ses énantiomères ((R)- et (S)-ketamine) et de ses métabolites ((2R,6R)- et (2S,6S)-hydroxynorketamine)) sur la dynamique de surface et la stabilisation synaptique des RNMDA dans les réseaux corticaux et hippocampiques. Nous utiliserons ensuite un modèle murin de dépression basé sur l’administration chronique de corticostérone pour explorer comment ces redistributions des RNMDA contribuent aux changements de connectivité cortico-mésolimbique induits par la kétamine, et nous réaliserons des tests comportementaux et pharmacologiques pour établir si le fait de moduler l’organisation synaptique des RNMDA favorise ou minimise les effets antidépresseurs ou psychomimétiques de la kétamine. Ce projet ambitieux et interdisciplinaire mené par un consortium dynamique et complémentaire - regroupant des expertises reconnues en neuroscience moléculaire, cellulaire et comportementale, en neuro-photonique et en pharmacologie - nous permettra de déterminer si l’action de la kétamine sur l’état mental pourrait être initiée par une réorganisation des RNMDA synaptiques à l’échelle nanométrique.

Ce projet porte sur l’organisation des circuits nerveux qui contrôlent les mouvements. Plus précisément, il vise à comprendre comment le cervelet et les centres de commande motrice du tronc cérébral agissent ensemble pour contrôler la posture. Le maintien postural et la mise en œuvre de mouvements harmonieux nécessitent que la force de chaque muscle soit continuellement ajustée à l'action motrice en cours d'exécution et aux conditions externes susceptibles d'altérer le mouvement. Or, chaque muscle est contrôlé, directement ou indirectement, par un empilement de centres de commande indépendants. Le cervelet est la seule structure se trouvant dans la position d’assurer une coordination motrice. D’une part il intègre des copies sensori-motrices de tout le corps et, d’autre part, projette en retour à tous les niveaux hiérarchiques du contrôle moteur. Néanmoins, les règles de connectivité entre afférences sensorielles, cervelet, et voies motrices descendantes permettant l’ajustement muscle à muscle restent à caractériser. Nous documenterons tout d’abord les hypothèses, soutenue par des résultats précédents et nos observations en cours, que i) des sous-groupes distincts de neurones descendants de la formation réticulée du tronc cérébral assurent chacun l’activation de groupes musculaires spécifiques et que ii) le cortex cérébelleux est organisé en microzones, chacune activée par des retours sensoriels proprioceptifs en provenance d’un muscle ou groupe de muscle spécifiques. Nous rechercherons ensuite, au sein des noyaux de sortie du cervelet, les neurones qui lient ces circuits sensoriels et moteurs muscle à muscle. D’une part, nous utiliserons des marquages rétrogrades viraux, initiés depuis un segment médullaire ou groupe de motoneurone spécifique de muscles impliqués dans le maintien postural. Nos résultats préliminaires suggèrent l’existence d’une organisation modulaire des neurones descendants du tronc cérébral, notamment de populations de neurones réticulospinaux, permettant le contrôle rapide et individuel d’un muscle, ou groupe de muscles spécifique. D’autre part, à l’aide d’indicateurs fluorescents de l’activité neuronale, nous imagerons les activations des cellules principales du cortex cérébelleux en réponse à la mobilisation d’un faisceaux musculaire spécifique. Cela aboutira à une cartographie en microzones, possiblement organisées muscle-à-muscle, des champs récepteurs des fibres grimpantes responsables de l’apprentissage supervisé dans le cortex cérébelleux. Enfin, nous combinerons marquages antérogrades depuis ces microzones corticales, avec marquages rétrogrades trans-synaptiques depuis les neurones descendants. Cela révèlera, comment les noyaux de sortie du cervelet font l’interface entre processus d’intégration sensorielle et commande motrice. Nous faisons l’hypothèse qu’un neurone de projection du cervelet contrôle un seul groupe musculaire, mais à plusieurs niveaux hiérarchiques, en intégrant l’information venant du cortex cérébelleux. Nos investigations anatomiques, centrales à ce projet, seront réalisées par une méthodologie combinant transparisation chimique de cerveaux entiers, microscopie à feuillet de lumière de pointe à haute résolution, et traçages anatomiques semi-automatisé. Cela permettra de reconstruire très précisément la position des neurones marqués, d’examiner une possible organisation somatotopique des voies révélées, de suivre les trajets axonaux de neurones individuels entre régions distantes, et de détecter des contacts synaptiques entre partenaires à l’échelle cellulaire. Ce projet propose un nouveau regard sur l’architecture fonctionnelle du contrôle moteur, dont les différents acteurs, souvent étudiés indépendamment, doivent coopérer pour l’exécution de mouvements harmonieux. Ces données seront, à terme, instrumentales pour comprendre et remédier aux déséquilibres moteurs dans des conditions pathologiques affectant le cervelet ou les voies spinales ascendantes et descendantes.

Les patients atteints de maladie de Huntington (MH) souffrent de troubles moteurs, cognitifs et comportementaux, avec des phénotypes hétérogènes et une évolution temporelle variable. Cela induit une forte variance des marqueurs de la MH dont aucun n’est actuellement suffisamment sensible pour mesurer la progression de la maladie dans de petites cohortes, prédire l’entrée dans la maladie chez des porteurs de la mutation (preMH) ou mesurer une évolution significative de leur état sur une fenêtre temporelle raisonnable. De plus, ils ne permettent pas une stratification fine des patients. La puissance de nouveaux outils spécifiques doit donc être testée de manière approfondie. Notre objectif est de définir un modèle de progression de la maladie et d'établir une stratégie d'enrichissement afin d'améliorer la sélection des patients pour les futurs essais thérapeutiques. Pour cela, nous combinerons des tests cognitifs nouvellement validés, des techniques d’imagerie multimodale de haut niveau, des marqueurs biologiques et une approche statistique innovante. Les outils cognitifs inclueront i) une batterie rapide (15 min) digitalisée dont notre équipe a démontré qu’elle permettait de réduire d’un facteur 5 le nombre de patients HD nécessaires pour évaluer l’efficacité d’un traitement, par rapport à des scores classiques (cUHDRS) ; ii) l’analyse du langage spontané permettant de classifier correctement des sujets sains, preMH et MH. L’imagerie multi-modale sur une caméra TEP-IRM comprendra un nouveau traceur TEP, le [18F]-MNI659 mesurant l’activité de la phosphodiestérase 10A, marqueur précoce de la MH, et des techniques d’IRM multimodales telles que la morphométrie, l’IRM de diffusion classique et NODDI, l’analyse de l’épaisseur corticale et de la morphologie des sillons corticaux. Les paramètres biologiques concerneront la mesure des neurofilaments à chaine légère, marqueur sanguin le plus précoce de la MH. Enfin, les analyses statistiques viseront à 1) définir un score composite multidomaine en présumant qu’il sera plus sensible pour mesurer des évolutions cliniques que des tests individuels ; 2) identifier des profils de patients et des trajectoires de progression de la MH grâce à une approche de clustering non supervisée ; 3) identifier les meilleurs prédicteurs, isolément ou combinés, et d'établir leur valeur pronostique sur l'évolution de la maladie. Ces outils seront appliqués sur 40 preMH, 20 MH et 20 contrôles sains. Ils bénéficieront des examens biologiques, d’imagerie, et des tests cognitifs à l’entrée et à 2 ans ainsi que d’un suivi clinique complet. La faisabilité de ce projet est garantie car les partenaires collaborent avec succès depuis plus de 20 ans et ont atteint un niveau d’excellence dans leurs domaines respectifs. Ainsi, le Partenaire 2 a une longue expérience dans l’imagerie fonctionnelle de la MH et vient d’embaucher un spécialiste de l’imagerie TEP de la phosphodiesterase 10A. Le Partenaire 1 (Henri Mondor) est le centre de référence national de la MH et son équipe de recherche a une expertise internationale en cognition dans cette maladie. Si notre projet réussit, il constituera une avancée importante dans le domaine en apportant des outils puissants pour suivre, et également prédire, l’évolution clinique des patients, dès la phase prodomique. A terme, nous pourrions définir un score composite permettant d’identifier les profils de patients les plus adaptés pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans des cohortes de tailles réduites lors d’essais cliniques moins longs et moins onéreux.

L’obésité dont la prévalence est d’environ 15% en France est un enjeu de santé publique et associe fréquemment des troubles du contrôle glycémique et un syndrome de l’intestin irritable (SII), conduisant à diminuer la qualité de vie. Le rôle du microbiote intestinal et de la fonction de barrière intestinale (BI) a été mise en avant dans ces troubles. Or, des données expérimentales et cliniques montrent que la glutamine améliore la fonction de BI dans différentes situations. Nous avons donc émis l’hypothèse qu’un apport oral de glutamine pourrait améliorer la fonction de BI et donc impacter positivement sur le contrôle glycémique et le SII. Notre projet vise donc à évaluer les effets de la glutamine chez la souris obèse et chez les patients obèses avec insulino-résistance et SII. La fonction de BI et le microbiote seront analysés et des manipulations de transfert de microbiote des patients vers la souris seront réalisées pour mieux appréhender les mécanismes d’action de la glutamine.

Les ß-thalassémies et la drépanocytose (SCD) sont causées par des mutations dans le gène de la ß-globine (HBB), aboutissant à une synthèse défectueuse (ß-thalassémie) ou à la production d’un variant anormal (SCD) de l'hémoglobine. Actuellement, le seul traitement curatif est la transplantation allogénique de cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais celle-ci est strictement limitée par la toxicité liée au conditionnement et à la disponibilité de donneurs compatible. Ainsi, l'apport d’une copie fonctionnelle de la ß-globine par un vecteur lentiviral (LV) représente une alternative thérapeutique intéressante et prometteuse. Cependant, l'administration et/ou l'expression inefficace du transgène ainsi que la compétition entre les CSH portant le gène corrigé et les CSH endogènes demeurent des obstacles majeurs à franchir. Dans ce projet, nous allons explorer deux nouvelles stratégies, probablement complémentaires, axées sur la modification du LV pour améliorer la thérapie génique des CSH dans le traitement des B-hémoglobinopathies. Ainsi, dans une première partie, nous modifierons un LV pour apporter un bénéfice in vivo aux CSH transduites en matière d’efficacité de homing et de prise de greffe, en modulant de façon transitoire les niveaux d'expression du récepteur de chimiokine CXCR4. Grâce à cette stratégie, les CSH corrigées seront en mesure de concurrencer les CSH non corrigées ainsi que les CSH endogènes, atteignant ainsi un niveau thérapeutique de prise de greffe, même avec un nombre réduit de CSH corrigées ex vivo. De plus, cette approche pourrait se traduire par un conditionnement plus supportable pour les patients – normalement requis pour améliorer la prise de greffon hématopoïétique par l’élimination des CSH endogènes affectées - réduisant ainsi la toxicité des tissus et des organes. Cette approche peut potentiellement bénéficier à de nombreuses maladies pouvant être traitées par thérapie génique à base de CSH. D'autre part, nous améliorerons le potentiel thérapeutique du traitement basé sur l’addition d’un gène, en exprimant le transgène HBB apporté par un LV et avec un microARN artificiel pour diminuer l'expression des protéines responsable de la maladie (protéine ß-globine muté pour SCD et l'excès de la protéine a-globine pour la ß-thalassémie). Nous espérons que la combinaison de ces deux stratégies permettra une meilleure correction des CSH du patient avec un plus faible nombre de copie de LV par cellule, compare à ce qui est déjà décrit. Enfin, nous combinerons les stratégies proposées à savoir celle améliorant le phénomène de homing et de prise de greffe et celle améliorant l'efficacité thérapeutique basé sur l’addition de gêne combiné à l’ARN interférence, pour un traitement de thérapie génétique curative optimisée. Grâce à ces améliorations du LV, nous espérons changer le but des essais cliniques de thérapie génique en cours, couramment limité à l’amélioration des signes cliniques et la réduction de la transfusion sanguine, par une guérison complète de la maladie.

L’hidradenite suppurée (HS; OMIM #142690) ou maladie de Verneuil est une maladie inflammatoire chronique de la peau qui affecte 1% de la population française. Les lésions se présentent sous forme d’abcès et de fistules très douloureux dans les zones riches en poils notamment les aisselles et la zone périnéale. Il s’agit de la pathologie dermatologique qui présente le retentissement le plus important sur la vie psycho-affective et socio-professionnelle du patient. La physiopathologie de l’HS est mal connue, cependant une occlusion du follicule pileux qui semble liée à une hyperkératinisation de l’épithélium folliculaire serait à l’origine de la maladie. Cela entraînerait une dilatation du follicule pileux qui éclaterait et libérerait des bactéries, des kératinocytes et de la kératine libre dans le derme initiant une inflammation aiguë et sévère. L’absence de résolution de l’inflammation entraînerait la formation de tunnels suppuratifs entre les différents abcès formés par la rupture des follicules. HS est notoirement difficile à traiter. La morbidité est extrêmement importante sans option thérapeutique efficace. Au 31 décembre 2018, aux États-Unis, seuls 17 essais cliniques dédiés à HS étaient achevés, et il n’y avait qu’un traitement approuvé par la FDA. L’un des obstacles principaux dans le développement de stratégies thérapeutiques efficaces est certainement causé par l’absence de mécanisme physiopathologique clair et par la grande hétérogénéité des patients. À ce jour, les différentes tentatives de classifier HS pour des essais cliniques, et d’identifier des sous-populations capables de réagir à des thérapies spécifiques reposent seulement sur la présentation clinique. Malgré les efforts effectués pour distinguer différentes catégories cliniques d’HS, une corrélation génotype-phénotype robuste n’a pas encore été établie. L’objectif principal de ce projet est de proposer une nouvelle approche afin de caractériser les patients fondée sur les avancées physiopathologiques que nous avons réalisées ces dernières années. Récemment, nous avons montré qu’un sous-groupe de patients HS présente des cellules souches du follicule pileux (HF-SC) avec des anomalies caractéristiques du stress réplicatif. Une anomalie de la différenciation du follicule pileux des patients HS serait à l’origine de dommages de l’ADN génomique ce qui aboutit à une réponse inflammatoire à travers l’accumulation de fragments d’ADN cytosolique et l’activation de STING (Orvain, JCI, 2020). Cette observation : i) réconcilie les anomalies de développement du follicule pileux et l’inflammation chronique ; ii) ouvre la voie à l’identification de nouvelles hypothèses épigénétiques et génétiques associées à ces anomalies biologiques ; iii) fournit de nouveaux outils pour définir des biomarqueurs qui permettent l’identification d’un sous-groupe de patients et de définir de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques. Pour atteindre ces objectifs, nous avons développé un programme sur trois ans, avec 3 Work Packages : i) dans le WP1, nous étendrons notre bio-banque d’ORS de patients HS pour mieux déterminer les patients qui présentent ou non un stress réplicatif au niveau des cellules souches du follicule pileux ; ii) le WP2 se concentrera sur le déchiffrage des mécanismes moléculaires qui dirigent le stress réplicatif des cellules souches du follicule pileux, en utilisant des patients avec ou sans stress réplicatif bien catégorisés grâce à une approche OMIC ; iii) le WP3 utilisera une approche intégrée des déterminants cliniques, biologiques et OMICs afin d’analyser l’hétérogénéité HS. L’impact attendu de nos résultats est d’aider à déterminer si des signatures immunologiques distinctes peuvent être identifiées en lien avec des phénotypes cliniques spécifiques qui pourraient être utilisés comme des biomarqueurs potentiels pour le pronostic de la maladie et/ou pour définir une thérapie ciblée.

Certaines maladies cardiovasculaires (par exemple le syndrome congénital du QT long, cLQTS) ou le syndrome du QT long induit par les médicaments (diLQTS), peuvent provoquer une forme particulière d'arythmie ventriculaire appelée Torsade de Pointes (TdP), qui peut dégénérer entraînant la mort. Il existe trois formes principales de cLQTS : le type 1, causé par des mutations dans les gènes des canaux cardiaques conduisant au blocage du courant des IKs; le type 2, blocage des IKr et le type 3, activation des INaL. Sur l'électrocardiogramme (ECG), l'intervalle QT est prolongé dans toutes ces conditions, mais les formes d'onde de l'ECG présentent des spécificités. La plupart des médicaments responsables du diLQTS et éventuellement de la TdP, peuvent être identifiés en évaluant s'ils agissent sur ces mécanismes physiologiques. Les organismes de réglementation exigent que les nouveaux médicaments fassent l'objet d'études approfondies sur l'intervalle QT. Il est cependant établi que l'intervalle QT est peu prédictif de la TdP. La prédiction du risque de TdP et la caractérisation des mécanismes moléculaires impliqués sont d'un intérêt majeur pour les patients suspectés d'être porteurs de cLQTS comme pour les autres patients recevant des médicaments susceptibles de provoquer la TdP. C'est également un problème majeur pour l'industrie pharmaceutique lorsqu'elle développe de nouveaux médicaments. Enfin, la plupart des médecins qui prescrivent ces médicaments sont dans l’incapacité de quantifier correctement l'intervalle QT ou d'évaluer le risque de TdP et n'ont pas un accès immédiat à une consultation d'expert en cardiologie. La prédiction personnalisée automatisée du risque de TdP des patients cLQTS ou diLQTS, peut améliorer la précision de l'évaluation du médecin et réduire le risque d'événements indésirables. Nous visons ici à développer un tel outil utilisant l'intelligence artificielle (IA), qui est en train d'atteindre rapidement la pratique médicale. L'apprentissage profond (AP) en particulier a apporté un changement radical dans le domaine de la reconnaissance des formes et de l'apprentissage machine lui-même, améliorant la plupart des modèles antérieurs telles que la classification des images et le traitement du langage naturel. Plus précisément, en cardiologie, l’AP a récemment été utilisée pour plusieurs applications, notamment la détection de divers types d'arythmies courantes telles que la fibrillation auriculaire, l'infarctus du myocarde, etc. Cependant, son utilisation pour prédire les événements de TdP dans un contexte médicamenteux et congénital n'a pas encore été explorée. Dans ce projet, nous utiliserons ces algorithmes pour améliorer la précision, mais aussi pour fournir aux cliniciens de nouvelles stratification des patients. Enfin, nous rechercherons à améliorer l’interprétabilité des modèles et par conséquent la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents à la TdP. Au sein du consortium, nous avons déjà exploré l’AP dans ce contexte et nos résultats préliminaires sont très encourageants. L'objectif du projet est de faire progresser ce sujet de recherche et de créer une application translationnelle déployé dans plusieurs services de cardiologie pilotes. Ce projet impliquera 5 équipes. Les équipes 1,4 sont des experts en IA et en interprétabilité et les équipes 2,3,5 sont des experts en cardiologie (cLQTS, diLQTS et TdP). De plus, ils disposent de données uniques. Le projet durera 42 mois. Les principaux résultats comprendront (i) dépôt intégré de données, (ii) des modèles DL prédisant la TdP, (iii) la stratification amélioré des patients et l'interprétabilité des modeles et (iv) une application clinique. Ce projet est en parfaite cohérence avec les objectifs du gouvernement et de l'ANR d'accélérer les applications translationnelles basées sur l'IA en médecine et renforcera très probablement la position de la France sur la scène internationale.

CADASIL est une maladie neurovasculaire héréditaire de l’adulte à transmission autosomique dominante due à des mutations de NOTCH3. Elle se caractérise par un spectre variable de symptômes, même au sein des familles, notamment des infarctus sous-corticaux récurrents, une démence et, moins fréquemment, des crises de migraine et des symptômes psychiatriques. Nous avons récemment découvert que la mutation p.Arg1231Cys est présente à une fréquence très élevée dans une population isolée en Italie (Nutile et al. 2019). Par des évaluations neurologiques approfondies (y compris IRM) et une collecte de facteurs de risque vasculaire dans cette population, ainsi que la comparaison avec les collections de patients de l’hôpital Lariboisière à Paris, ce projet vise à étudier la pathogénèse et la variabilité phénotypique de CADASIL pour cette mutation, à identifier de nouveaux biomarqueurs via des corrélations possibles entre les phénotypes cliniques et à détecter de nouveaux facteurs génétiques.

Le cerveau est notre organe le plus précieux. C'est pourquoi cet organe est le mieux protégé de notre corps. L'élément clé protecteur de notre système cérébral est la barrière hémato-encéphalique (BHE) qui protège notre cerveau contre les agents pathogènes et les toxines qui peuvent être présents dans notre sang. Cependant, cette protection peut jouer contre nous dans le cas de certaines maladies cérébrales. La BHE, jusqu’à présent un atout essentiel pour combattre toutes les agressions extérieures devient un facteur limitant dans le combat contre ces maladies cérébrales. En effet la BHE limite la diffusion de médicaments qui pourraient agir contre ces maladies. Par exemple, le glioblastome (GBM) une tumeur cérébrale très agressive, reste essentiellement incurable même si le BHE est compromis par la présence de la tumeur. En effet la croissance tumorale induit une vascularisation tumorale anormale qui conduit à une altération de la BHE (appelé dans ce cas barrière hémato-tumorale (BTB)). Cette altération pourrait être bénéfique pour la diffusion du médicament dans la tumeur. Cependant, la majorité des médicaments anticancéreux approuvés n'améliore pas la survie des patients GBM. Plusieurs aspects peuvent expliquer l'échec de proposer une option de traitement efficace contre la GBM principalement parce que le BTB présente un certain degré d'hétérogénéité avec certaines régions présentant une BHE intact ou présentant une faible altération de la BTB. Une délivrance des traitements non homogène dans toutes les régions du GBM est vouée à l’échec clinique. C'est le cas notamment de l'immunothérapie qui pourrait aider à restaurer l'activité du système immunitaire inhibée par la présence des cellules tumorales. L'immunothérapie est une formidable promesse en tant que stratégie d'éradication des tumeurs solides. Cependant les thérapies utilisant des anticorps monoclonaux (mab) ont échoué dans le GBM en raison de la faible capacité des mAb à traverser la BHB et la BTB. Dans le projet IM²FUS, nous proposons d'étudier une stratégie thérapeutique et diagnostique (appelée théranostique) innovante pour surmonter cette limitation de passage de médicaments avec une méthode basée sur l’utilisation d’ultrasons. Il a été prouvé qu’utiliser des ultrasons permet la diffusion de divers médicaments dans le cerveau sans induire de lésions cérébrales. Grâce à des microbulles (MB), cette méthode non invasive crée une manière localisée et transitoire d'ouvrir la BHE et la BTB. Dans IM²FUS, nous profitons de cette perturbation de la BHE et de la BTB par ultrasons couplés à des MB pour créer une synergie entre un boost d'activité immunologique par les mAb, l'augmentation de l'activité des cellules T cytotoxiques et l’activation des cellules gliales pour lutter contre la tumeur. Afin d’optimiser l'action de cette synergie, nous proposons de développer une méthode d'imagerie biomédicale fonctionnelle. Il sera possible non seulement de suivre l'évolution de la maladie au cours du traitement mais également de proposer un score intelligent basé sur la quantification de biomarqueurs du système immunitaire. Ce score pourrait prédire l'efficacité de la stratégie à base de mAb et d’ultrason localisé. ImmunoTEP, qui combine la haute affinité des mAb et la haute sensibilité de la tomographie par émission de positons (TEP) sera utilisée pour étudier l’activité du système immunitaire ainsi que l’efficacité du boost induit par ultrason sur le passage des mAb dans le cerveau. Dans ce projet, les mécanismes biologiques clés impliqués par les ultrasons combinés avec les mAb seront étudiés en profondeur en utilisant des approches complémentaires (TEP in vivo, immunohistochimie, biologie moléculaire et biochimie) dans un modèle orthotopique préclinique qui imite de nombreuses caractéristiques du phénotype GBM humain.

Les maladies respiratoires chroniques, y compris la fibrose pulmonaire sont une cause importante de morbidité et de mortalité. La fibrose pulmonaire se caractérise par un dépôt excessif de matrice conduisant à une destruction de l’architecture pulmonaire et de manière ultime à une diminution de la fonction respiratoire. La fibrose idiopathique (FPI) est la forme la plus courante de fibrose pulmonaire, avec un taux de mortalité élevé. Elle résulte d’une activation aberrante des cellules épithéliales alvéolaires qui provoque une migration excessive, une prolifération et une activation des fibroblastes avec formation de foyers (myo) fibroblastiques et dépôt excessif de matrice extracellulaire. La nécessité de développer des traitements innovants pour la fibrose pulmonaire est apparue comme un défi thérapeutique important. Un nombre croissant d’études révèle le rôle d’un stress oxydatif chronique dans la progression de la fibrose. Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) ainsi que des marqueurs du stress oxydatif sont élevés dans la FPI et le niveau de ROS qui corrèle négativement avec la fonction pulmonaire peut prédire la sévérité de la maladie. Les cellules peuvent produire des ROS par l'activation et/ou l'induction de NADPH oxydases. Ces protéines membranaires constituent une famille d’enzymes qui comporte sept membres : cinq NOXs (NOX1-5) et deux dual Oxydases (DUOX1 et 2). Les DUOXs génèrent de l’H2O2 à la surface des cellules. Nos données in vivo (Patients FPI, modèle murin de fibrose pulmonaire) montrent que l’expression de DUOX1 est induite dans le tissu fibreux, notamment dans les cellules épithéliales et dans les foyers myofibroblastiques. Les souris déficientes en DUOX1 (DUOX1+/- et DUOX1-/-) sont protégées de la fibrose pulmonaire expérimentale. L’analyse du mécanisme a révélé que DUOX1 via l’H2O2 qu’elle produit, amplifie et maintien l’activation de la voie de signalisation du TGF-B1, avec pour conséquence une activation chronique des fibroblastes et le développement de la fibrose. DUOX1 devient donc une cible thérapeutique. L’objectif de ce projet est de développer une stratégie thérapeutique innovante basée sur l'utilisation d'aptamères. Ces molécules sont des oligonucléotides (ADN ou ARN) qui peuvent se replier en structures 3D complexes et se lier à des cibles avec une affinité et une spécificité élevées en fonction de la complémentarité de forme, inhibant ainsi la fonction. Plusieurs thérapies aptamères pour d'autres maladies se sont révélées prometteuses dans les essais cliniques. Le projet est divisé en trois tâches : Tâche 1 : sélection d’aptamères résistants aux nucléases, en chimie ARN 2’Fluoro-pyrimidine, dirigés contre la protéine DUOX1 en utilisant une stratégie de SELEX sur cellules entières. La lignée cellulaire HEK293 inductible pour DUOX1 sera utilisée à cette fin, Tâche 2: Identification et caractérisation fonctionnelle des candidats aptamères en analysant leur capacité à inhiber le processus de différenciation myofibroblastique induit par le TGF-B1 et ce, à partir de fibroblastes pulmonaires murins et humains et Tâche 3: évaluation de l’efficacité thérapeutique des aptamères sélectionnés en utilisant un modèle murin de fibrose pulmonaire induite par la bléomycine Ce projet devrait conduire à l’identification d’aptamère(s) dirigés contre DUOX1 en tant qu’outils thérapeutiques prometteurs ayant le potentiel de contrer le processus pathologique de cette maladie pulmonaire chronique mortelle. De plus, au cours de la rédaction de cette demande de financement, il est apparu évident qu’une fibrose pulmonaire grave pouvait être induite par le nouveau coronavirus, le SRAS-CoV-2. En conséquence, nous pensons que ces aptamères pourraient également être utiles pour réduire la fibrose pulmonaire dans d'autres pathologies. Ce projet rassemble 2 équipes (C. Dupuy et F. Ducongé) et leurs savoir-faire, très complémentaires, associant une expertise en stress oxydant et NADPH oxydases et Aptamères.

L'insuffisance cardiaque (IC) est l'une des principales maladies cardiovasculaires. Elle est définie comme l'incapacité du cœur à répondre aux besoins du corps. L'IC constitue un problème de santé majeur, touchant 1 à 2% de la population adulte dans les pays industrialisés. Au cours des dernières décennies, d’énormes progrès ont été réalisé dans le traitement de l’IC, cependant aucun remède n'existe et la mortalité à 5 ans reste très élevée (approximativement 50%). Une caractéristique de l'IC est l'activation persistante de la voie de signalisation ß-adrénergique/AMPc qui conduit à l'activation chronique de la protéine kinase-A (PKA) responsable du remodelage cardiaque, de l’apoptose des cardiomyocytes et du développement de la fibrose cardiaque. Les ß-bloquants sont à la base de la thérapie de l'IC. Cependant, ils sont responsables d’effets secondaires importants et sont inefficaces chez environ 50% des patients atteints d'IC. Par conséquent, il devient impératif d'améliorer et/ou de proposer de nouvelles thérapies pour traiter l'IC. Idéalement, ces nouvelles thérapies devraient reposer sur la délivrance rapide de molécules thérapeutiques spécifiquement au myocarde. Une telle stratégie améliorerait le traitement des maladies cardiovasculaires (les cardiomyopathies hypertrophiques, l'IC aiguë ou chronique, les troubles du rythme) et supprimerait ou minimiserait les effets secondaires indésirables. Il a été décrit dans la littérature que les peptides CTP et PCM ont la capacité se lier préférentiellement aux cardiomyocytes et de les intérioriser. Cependant, la caractérisation de ces agents est limitée et leur efficacité de ciblage reste faible. Par conséquent, nous avons développé plus de 100 variants à partir des séquences peptidiques originales et nous avons sélectionné de nouveaux peptides optimisés de ciblage cardiaque préférentiel (PCCP). Nous pensons que nos PCCP offriront une nouvelle classe de produits thérapeutiques une fois couplés à une cargo-médicament pour le traitement de l'IC. CardioTarget vise à développer une plate-forme d'administration efficace de médicaments ciblée au cœur défaillant. Pour cela, l'inhibiteur de la PKA (PKI) sera encapsulé dans des liposomes greffés avec les PCCP optimisés, permettant ainsi une délivrance rapide et efficace du PKI spécifiquement aux cardiomyocytes pour le traitement de l'IC. Au cours du projet, nous allons: 1/ Caractériser l'efficacité et la spécificité des PCCP couplé au PKI dans des modèles pharmacologiques (in vitro et ex vivo) à inhiber la PKA cardiaque; 2/ Développer des systèmes de délivrance originaux conjugués au PCCP pour améliorer leur stabilité plasmatique et la délivrance cardiaque in vivo; 3/ Évaluer l'efficacité des vecteurs thérapeutiques cardiaques spécifiques (liposomes greffés PCCP) dans l'administration de PKI comme thérapeutique dans un modèle physiopathologique de l'IC. CardioTarget développera de nouvelles plateformes spécifiques de ciblage cardiaque afin de favoriser une délivrance efficace et préférentielle de médicament. Ces plateformes favoriseront le développement de nouvelles approches thérapeutiques (peptides ou acides nucléiques) pour le traitement des maladies cardiaques avec une amélioration de l'indice thérapeutique.

Le sepsis (communément appelé septicémie) se caractérise par une réaction inflammatoire systémique exacerbée en réponse à une infection généralisée. Ordinairement, la détection de molécules bactériennes étrangères par le système immunitaire, provoque l'activation des monocytes et la production de cytokines pro-inflammatoires, cette cascade de signaux stimulant le recrutement de nouvelles cellules immunitaires pour combattre l'infection. Cependant, pendant un sepsis, la présence de pathogènes dans le sang engendre une activation incontrôlée et excessive du système immunitaire pouvant provoquer une hypotension, une défaillance multiviscérale et éventuellement la mort du patient. A l’exception de traitements antibiotiques associés à une assistance cardiaque et respiratoire, il n'y a actuellement pas de thérapies reconnues contre le sepsis. Ce manque de stratégies thérapeutiques entraîne un fort taux de mortalité, pouvant aller jusqu’à 50% en cas de choc septique. Ainsi selon l’OMS, plus de 6 millions de personnes par an meurent des conséquences d’un sepsis. L’obstacle principal rencontré lors du développement de traitements immunomodulateurs contre le sepsis est la coexistence de phases d'hyper-inflammation et d'hypo-inflammation. Les médecins s’accordent sur le fait que bien que les thérapies anti-inflammatoires traditionnelles réduisent la mortalité précoce, leurs effets non ciblés peuvent exacerber la phase immunosuppressive et augmenter la mortalité tardive. Nous pensons donc que pour être efficaces, les stratégies thérapeutiques d’immunomodulation doivent présenter 2 caractéristiques importantes : un effet rapide, et une sélectivité envers l'inflammation systémique afin de protéger l'intégrité du système immunitaire nécessaire pour combattre l'infection. Basé sur ce constat nous proposons de développer une série de nanoparticules dotées d’une forte affinité envers les monocytes pro-inflammatoires sanguins. En effet, ces cellules se trouvent très en amont dans le mécanisme de la pathologie, de plus elles sont facilement et rapidement accessibles par des nanoparticules administrées par voie intraveineuse. Ces nanoparticules nous serviront pour le transport d’un nouvel inhibiteur spécifique ayant déjà démontré une activité anti-inflammatoire ciblé sur les monocytes mais ne portant pas préjudice au système immunitaire de l’hôte. La première partie de notre projet sera de développer toute une série de nanoparticules de différentes compositions chimiques afin d’obtenir les meilleures formulations en termes de taille, d’efficacité de chargement et de stabilité. Les formulations les plus prometteuses seront testées dans différents modèles cellulaires afin de mesurer leur ciblage envers les monocytes pro-inflammatoires ainsi que leurs effets anti-inflammatoires. Les meilleures nanoparticules seront finalement expérimentées dans différents modèles souris de sepsis afin d’établir leur biodistribution, leur pharmacocinétique ainsi que leur efficacité thérapeutique. Nous pensons que grâce à notre combinaison unique alliant adressage cellulaire (nanoparticules) et sélectivité moléculaire (inhibiteur spécifique), notre stratégie permettra la réduction de la composante inflammatoire du sepsis sans affaiblir le système immunitaire.

Le développement de nouvelles méthodes de diagnostic précoce, de pronostic et de stratégies thérapeutiques repose sur la découverte de biomarqueurs. Grâce à nos premiers résultats brevetés, un nouvel outil de spectrométrie de masse isotopique (IRMS) sera développé et exploité pour accéder à l’analyse isotopique position spécifique (PSIA). L'azote 15 en abondance naturelle des différentes positions d'atomes d'azote sera mesuré au sein d'intermédiaires du cycle de l'urée modifié dans le cancer et sur un ensemble d'échantillons d'une banque de tissus du cancer du sein afin d'accéder à l'origine métabolique de signatures isotopiques spécifiques en utilisant la modélisation de flux isotopique. Ce projet rassemble un consortium d'experts en isotopes de renommée internationale et une entreprise mondialement reconnue en IRMS qui contribuera à la fabrication d'un système adapté aux analyses de routine PSIA pour l'analyse de biomarqueurs innovants dans le cancer et dans divers d'autres domaines.

L’augmentation de la prévalence des maladies rénales est un problème majeur de santé publique du fait du coût des traitements au stade terminale de ces maladies (dialyse ou transplantation). Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes physiologiques et physiopathologiques du rein et notamment ceux de la paroi capillaire glomérulaire impliquée dans la première filtration du sang afin de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet interdisciplinaire a pour objectif principal de développer une plateforme microfluidique innovante reproduisant cette paroi. Le but ici est d’adresser la question suivante : peut-on modéliser la physiologie de la paroi capillaire glomérulaire et étudier en temps réel les effets induits la néphropathie extramembraneuse et le syndrome néphrotique idiopathique à l’aide de cette plateforme innovante ? Afin de répondre à cette question biomédicale, la plateforme microfluidique permettra : (i) la génération d’une membrane à partir d’un hydrogel de collagène de type IV mimant la membrane basale glomérulaire, (ii) la différenciation de cellules souches pluripotentes induites en cellules glomérulaires (podocytes et cellules endothéliales) et leur culture de chaque côté de la membrane d’hydrogel et (iii) l’intégration de capteurs associés à une instrumentation permettant de mesurer et de suivre en temps réel, par spectroscopie d’impédance, les modifications physiopathologiques de la paroi capillaire glomérulaire reconstruite dans ce microsystème.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont hétérogènes sur le plan génétique et clinique. Malgré les énormes progrès encourageants de la recherche au cours des dernières années, ces maladies entraînent toujours une cécité légale en raison du nombre limité d’options thérapeutiques. Le succès récent de supplémentation génique chez les patients atteints d’amaurose congénitale de Leber (ACL) causée par des mutations RPE65 a montré le réel intérêt pour étendre cette approche à d’autres DRH. Nos travaux antérieurs suggèrent que les mutations dominantes liées à CRX, un facteur de transcription essentiel au développement et à la maturation des photorécepteurs, représentent des candidats pertinents pour la thérapie génique. À ce jour, plus de 50 mutations du gène CRX sont responsables des dystrophies à cône-bâtonnet (CORD), de l'ACL et de la rétinite pigmentaire (RP). En raison de l'hétérogénéité clinique des patients porteurs de mutations dans le gène CRX, notre projet vise à restaurer et/ou maintenir la vision dans deux modèles murins de rétinopathies associées à CRX : un modèle d’ACL que nous avons déjà bien caractérisé et un nouveau modèle de CORD. Dans ce contexte, nous évaluerons si notre approche de thérapie génique est capable de compenser les effets délétères des mutants CRX dans ces deux formes. Par conséquent, un vecteur AAV exprimant CRX sera administré, et son efficacité à long terme sera évaluée, dans les deux modèles. Après l'administration du vecteur, la récupération et/ou la préservation de la fonction rétinienne seront testées par des réponses d’électrorétinogramme et de réflexe optocinétique, et la morphologie rétinienne par tomographie par cohérence optique. L'étude sur l'efficacité et la toxicité sera complétée par des analyses histologiques et moléculaires. Afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et de valider l'approche thérapeutique chez l'homme, nous utiliserons également des organoïdes rétiniens dérivés d'iPSC de trois patients porteurs de différentes mutations dans CRX et atteint de LCA, CORD ou RP. En analysant l'expression différentielle des gènes et des protéines, ainsi que la morphologie des organoïdes tout au long de la différenciation et de la maturation de la rétine, nous établirons une corrélation génotype-phénotype et, par conséquent, nous éluciderons les bases des profils cliniques différentiels associés à chaque mutation. De plus, nous obtiendrons des données pertinentes pour tester l'efficacité d’une supplémentation génique par vecteur AAV après transduction des organoïdes de patient. De cette façon, nous déterminerons si toutes les formes peuvent bénéficier de notre approche thérapeutique, sans effets négatifs liés à la surexpression du CRX. Au terme de cette étude préclinique, nous aurons démontré l'efficacité de notre thérapie génique chez des modèles murins et humains présentant des mutations dominantes de CRX. La valeur clinique potentielle de ce projet réside dans le développement d’une thérapie génique traitant un large spectre de rétinopathies associées à CRX et pourrait servir de preuve de concept pour les autres DRH dominantes. Cette étude pourrait servir de base à la poursuite du développement d’essais cliniques.

Les dermatoses inflammatoires incluent deux pathologies multifactorielles, le psoriasis et la dermatite atopique, de prévalence mondiale très élevée. Les traitements actuels, topiques ou systémiques, ont une efficacité souvent partielle car ne ciblant qu’une seule composante de la maladie (système immunitaire ou inflammation épidermique). Notre projet porte sur une nouvelle émulsion de Pickering, composée de nanoparticules de PLGA encapsulant un immunosuppresseur (i.e. tacrolimus ou ciclosporine A) et stabilisant une phase huileuse contenant un anti-inflammatoire (calcitriol) pouvant réguler activation et prolifération épidermique. Le projet vise à établir la preuve de concept de l'activité de ces nouvelles émulsions topiques en tant que nouveau traitement topique unique et innovant dans les dermatoses inflammatoires, en recherchant son efficacité, d'une part, par des expériences in vitro sur des cellules cutanées et immunitaires isolées ainsi que sur des explants cutanés de donneurs sains ou de lésions de patients, et d'autre part, par des expériences in vivo dans une étude préclinique menée sur un modèle murin dédié à mimer le psoriasis ou la dermatite atopique. À l'avenir, une étude clinique de phase I de l'application topique des émulsions de Pickering pourrait être menée en collaboration avec des partenaires industriels, sachant que les substances actives co-encapsulées dans les émulsions sont déjà administrées chez l'homme et que l'utilisation des nanoparticules de PLGA a été validée par la FDA et l'EMA. Pour conduire au mieux ces principaux objectifs, une étude de physico-chimie approfondie est nécessaire au fur et à mesure pour clarifier les propriétés physico-chimiques de l'émulsion et le mécanisme de stabilisation de l'interface eau / huile, au bénéfice des applications pharmaceutiques.

Le chaperon d’histones ASF1 joue un rôle crucial dans le maintien de l’information épigénétique portée par les histones H3-H4. La surexpression d’ASF1B induit la prolifération des cellules tumorales et constitue un marqueur performant de mauvais pronostique pour le cancer du sein. ASF1 est également impliqué dans le vieillissement cellulaire et est nécessaire au cycle de certains virus pathogènes. Ces propriétés font d’ASF1 une cible thérapeutique nouvelle et ont motivé la conception d’inhibiteurs peptidiques par l’un des partenaires du projet. Cependant, ces peptides pénètrent peu dans les cellules et sont dégradés rapidement in vivo par des protéases. Ce projet PRCE qui associe trois laboratoires français et une SME vise à développer par des approches peptidomimétiques variées des inhibiteurs aux propriétés pharmacologiques améliorées ainsi que des sondes moléculaires pour explorer l’effet de l’inhibition d’ASF1 dans les cellules et in vivo et en démontrer le potentiel thérapeutique.

En raison de l’absence de traitement curatif des maladies dégénératives de la rétine, les stratégies de thérapie cellulaire visant à remplacer les cellules dégénérées font l'objet d'une attention considérable. Bien que l'approche basée sur la transplantation de photorécepteurs soit très prometteuse, des résultats fonctionnels limités ont été obtenus jusqu'à présent. La récupération fonctionnelle précédemment observée peut être le résultat du transfert de matériel cytoplasmique des cellules transplantées vers les photorécepteurs hôtes restants, plutôt que par une réelle intégration dans la rétine du receveur. L'intégration fonctionnelle des photorécepteurs transplantés dans la rétine de l'hôte nécessite une connexion à la rétine interne de l'hôte mais aussi le développement de segments externes photosensibles, nécessitant une interaction avec l’épithélium pigmentaire sous-jacent. Dans les modèles de rongeurs dont la rétine est fortement dégénérée, les précurseurs de photorécepteurs transplantés n'ont pas réussi à développer des segments externes normaux avec une polarité correcte. Pour tenter de surmonter ces problèmes, la stratégie que nous proposons ici consiste à combiner la thérapie cellulaire basée sur l’utilisation des cellules souches pluripotentes (iPS) et l'optogénétique afin de conférer une sensibilité à la lumière aux cellules du donneur. Nous introduirons un optogêne spécifique (pompe à chlorure hyperpolarisante) dans les cellules iPS pour produire des photorécepteurs fonctionnels basés sur l'activité de cette opsine microbienne, même en l'absence de segments externes correctement formés. L'avantage majeur de notre stratégie est donc la synergie entre le remplacement cellulaire et la thérapie optogénétique qui permet de restaurer à la fois la structure de la rétine avec des dérivés de cellules souches et la fonction visuelle avec des opsines microbiennes. Le deuxième grand problème que pose l'utilisation des cellules iPS humaines pour la thérapie cellulaire est la survie des dérivés de cellules souches greffées dans les modèles de xénogreffes, généralement utilisés pour valider les avantages de la transplantation de cellules dans les maladies neurodégénératives. Étant donné que la xénotransplantation chez les rongeurs immunodéprimés ne peut pas modéliser la réponse immunitaire de l'hôte à des greffes transgéniques et allogéniques spécifiques, elle ne peut pas vraiment prédire le résultat de l'efficacité de la transplantation chez l'homme. Nous proposons ici d'évaluer la transplantation chez des primates non humains (PNH) dans des situations allogéniques via la génération de photorécepteurs dérivés de cellules iPS de macaques avec des haplotypes correspondants ou non à ceux des macaques receveurs. Les modèles PNH sont aussi beaucoup plus pertinents que leurs homologues chez les rongeurs car leur rétine présente une anatomie et une fonction proche de celles de l'homme, essentiellement en raison de la présence d'une fovéa, la région spécifique ciblée par la thérapie cellulaire pour le remplacement des photorécepteurs. Ainsi, nos objectifs spécifiques sont : i) d'intégrer par la stratégie CRISPR/Cas9 une opsine microbienne dans les cellules iPS humaines et de PNH ; ii) de générer et d'isoler une population homogène de précurseurs de photorécepteurs exprimant l’optogène issus des cellules iPS humaines et de PNH; et iii) d'évaluer les propriétés fonctionnelles de ces précurseurs de photorécepteurs modifiés dans un modèle macaque de dégénérescence des photorécepteurs. Les résultats obtenus seront essentiels pour documenter le potentiel thérapeutique de la combinaison de la thérapie optogénétique et de la thérapie à base de cellules souches en vue de développer de nouvelles thérapies sûres et efficaces pour les dégénérescences de la rétine humaine.

La douleur postopératoire est l’un des symptômes les plus difficiles à supporter par les patients, pour lesquelles de nouvelles solutions efficaces sont nécessaires. Pour la soulager, des antalgiques sont administrés par voies topique ou parentérale, mais ces molécules ont une courte durée d’action. La douleur peut être liée à des contraintes mécaniques qui peuvent apparaître lors de l’utilisation de colles utilisées pour faire adhérer les tissus, ce qui tend à engendrer de nouvelles sources de douleur. Par exemple, les colles à base d’acrylates forment une matrice rigide qui peut heurter la structure molle des tissus biologiques qui de plus évoluent lors de la guérison des plaies. Il n’existe pas à l’heure actuelle de système capable à la fois de coller en douceur des tissus tout en libérant localement un analgésique. Notre projet vise à apporter une solution innovante, en développant un système adhésif « mou » (nommée ici SoftGlue). Une batterie d’essais in vitro sera déployée afin de minimiser les études in vivo. Tout d’abord, les propriétés adhésives de SoftGlue seront étudiées et comparées aux produits commerciaux. Les propriétés mécaniques et adhésives seront analysées par un ensemble de méthodes complémentaires comprenant des tests standardisés et la microscopie sous cisaillement afin de mimer les conditions in vivo (contraintes thermomécaniques, flux sanguin). Ainsi, nous chercherons à comprendre le mécanisme d’action de SoftGlue. Les systèmes les plus performants in vitro seront étudiés in vivo. Ce projet est une occasion de bâtir un consortium interdisciplinaire sur une thématique à fort impact sociétal.

VLFMRI vise à développer un système d'Imagerie par Résonance Magnétique (IRM) à très bas champ comme modalité alternative à l’IRM conventionnelle à haut champ pour l’imagerie continue du nouveau-né prématuré afin de détecter la présence d’hémorragies ou d’ischémies. Ce système est basé sur une combinaison d’une nouvelle génération de capteurs magnétiques à base d'électronique de spin, de séquences d’acquisition optimisées et d’un système compatible avec une mesure en couveuse qui permettront d'atteindre une résolution d'image de 1mm3 sur un corps entier de bébé en un temps court. Ce projet est un partenariat de trois partenaires académiques et deux services hospitaliers. Les différentes étapes du projet sont la fin du développement du système au niveau hardware et software, la validation préclinique sur petit animal et la validation clinique.

La thrombo-inflammation est un mécanisme physiopathologique clé dans de nombreuses pathologies. Elle est causée par l’activation des cellules endothéliales dans les tissues en souffrance, entraînant une microthrombose secondaire qui amplifie les dommages tissulaires. A ce jour, les techniques d’imagerie disponibles ne détectent que les conséquences de la thrombo-inflammation. Ainsi, la possibilité de détecter les premières étapes de la thrombo-inflammation par imagerie permettrait non seulement d’améliorer notre connaissance des pathologies thrombo-inflammatoires, mais aussi d’offrir une fenêtre thérapeutique pour prévenir les atteintes irréversibles. Dans ce projet, nous souhaitons développer une méthode d’imagerie de la thrombo-inflammation en utilisant l’imagerie moléculaire par résonance magnétique. Cette méthode sera ensuite utilisée dans des modèles expérimentaux de pathologies thrombo-inflammatoires comme l’AVC, l’hémorragie sous arachnoïdienne et l’inflammation systémique.

Le projet CPlay ambitionne le développement d’outils de rééducation fonctionnelle pour le membre supérieur d’enfants touchés par une paralysie cérébrale. La solution proposée combine l’utilisation 1) d’objets instrumentés de la vie quotidienne de l’enfant et 2) les techniques de réalité mixte. Ces outils de rééducation sont utilisables à la fois dans les centres de rééducation sous la supervision des rééducateurs, mais également à domicile avec une approche auto-rééducative permettant de prolonger et d’augmenter la fréquence des exercices, et de maintenir ainsi les bénéfices des séances de rééducation acquis en centre de rééducation. Cette approche vise également à stimuler l’intérêt de l’enfant aux exercices de rééducation fonctionnelle au travers de l’immersion dans un environnement de réalité mixte guidée par des jeux ludiques, et d’évaluer d’une manière transparente, objective et systématique ses progrès et/ou ralentissement à court et à long termes.

Le chloroplaste capte l’énergie lumineuse et la transforme en énergie chimique, permettant ainsi la vie sur terre. Issus de cyanobactéries, ils ont gardé un génome petit mais essentiel qui est entièrement transcrit sous forme de polycistrons. Les ARN matures et fonctionnels sont spécifiquement sélectionnés au sein du transcriptome primaire grâce à un ensemble de protéines de liaison à l’ARN et des ribonucléases. Parmis tous les processus d’expression génétique dans le chloroplaste, le rôle des ARN antisens et plus largement des processus impliquant les ARN double brin sont les plus mal connus. Il est supposé qu’une des enzymes clés dans ces processus est la RNase J qui a la particularité d’être à la fois une 5’-3’ exoribonucléase et une endoribonucléase. Elle mature les extrémités 5’ des ARN et permet d’éliminer les ARN antisens néfastes qui pourraient gêner la traduction. Le but du projet JOAQUIN est de mieux comprendre ce contrôle qualité des ARN chloroplastiques en (i) identifiant l’intégralité des isoformes des ARN chloroplastiques et des ARN double brins et (ii) en déterminant le rôle exact de la RNase J dans la maturation de ce transcriptome. Une attention particulière sera portée au rôle du domaine GT-1 de la RNase J qui est une spécificité de la partie C terminale de l’enzyme chez les plantes. Nous identifierons égalements les protéines et les acides nucléiques qui co purifient avec l’enzyme.

Les hormones peptidiques végétales sécrétées orchestrent le développement des plantes et régulent leurs interactions avec des microorganismes de la rhizosphère. Chez les plantes légumineuses, les bactéries bénéfiques fixant l'azote (BFA), les champignons mycorhiziens à arbuscules (CMA), et les nématodes à galles (NG) pathogènes déclenchent tous une reprogrammation transcriptionnelle du destin des cellules racinaires pour générer un environnement propice à leur interaction avec la racine-hôte. Alors que des gènes spécifiques de la plante codant pour différentes classes d’hormones peptidiques sont régulés par chacun de ces trois micro-organismes, les CMA et les NG produisent eux aussi des molécules mimant ces peptides, appelées peptides mimétiques. Dans le projet SYMPA-PEP, nous allons analyser le rôle de nouveaux peptides de signalisation, qui sont soit produits par les CMA et/ou les NG, soit induits chez la plante au cours de ces interactions symbiotiques. En se basant à la fois sur nos analyses récentes ayant permis l’identification de peptides mimétiques microbiens, ainsi que sur les progrès dans les connaissances des voies de signalisation des hormones peptidiques chez les plantes, nous allons caractériser le rôle de ces peptides dans la spécification des cellules racinaires au cours de la mise en place et/ou lors du maintien de ces interactions bénéfiques et parasitaires. Nous utiliserons la plante légumineuse Medicago truncatula comme modèle car elle permet d'étudier à la fois les interactions symbiotiques avec les CMA (Rhizophagus irregularis) et les BFA (Sinorhizobium meliloti), et une interaction plante-pathogène avec les NG (Meloidogyne incognita). Deux questions principales seront abordées dans le cadre du projet SYMPA-PEP : (i) quelle est le rôle de nouvelles hormones peptidiques végétales des familles IDA et CLE qui sont induites lors des symbioses bactérienne et mycorhizienne et/ou par les NG, et dont on anticipe qu'elles reprogramment des cellules racinaires pour favoriser l'établissement des interactions ; et (ii) quel est le rôle des peptides mimétiques de type CLE, CEP et IDA récemment identifiés in silico et codés par les CMA et/ou les NG. Nous utiliserons une combinaison d'approches génétiques, transcriptomiques et de biologie cellulaire, incluant l'utilisation de mutants, de stratégies de surexpression, de séquençage d'ARN à haut débit, de fusions de gènes rapporteurs analysées en microscopie confocale, pour caractériser la fonction et la régulation de ces hormones peptidiques végétales et microbiennes. L'objectif principal de ce projet sera de définir, pour chaque hormone peptidique sélectionnée, quelles cibles moléculaires et cellulaires sont spécifiquement recrutées, ou alternativement partagées, entre les interactions mutualiste et parasite. Cela permettra d'identifier les déterminants génétiques caractéristiques du recrutement de chacun de ces peptides dans une interaction biotique donnée, et la manière dont ils affectent de manière similaire/différente la croissance et le développement des racines. En étudiant les peptides mimétiques sécrétés par ces microorganismes, nous aurons l'occasion de découvrir des rôles conservés et potentiellement nouveaux par rapport à leurs homologues végétaux les plus proches. Enfin, en décrivant les voies de régulation et de signalisation de ces hormones peptidiques végétales ou microbiennes associées aux différentes interactions analysées, ce projet pourra permettre de concevoir des stratégies innovantes pour améliorer la protection des cultures contre les nématodes parasites, sans être préjudiciable pour les symbioses mutualistes, ainsi que pour stimuler les interactions plantes-microorganismes mutualistes dans le cadre du développement d‘une agriculture plus durable.