Cellules souches hématopoïétiques et développement des hémopathies myéloïdes

L'hématopoïèse clonale de potentiel indéterminé (CHIP) est associée à un risque accru de développer des maladies inflammatoires liées à l'âge. Ce phénomène serait lié à une différenciation biaisée des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en cellules myéloïdes inflammatoires, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués restent mal compris. La CHIP est principalement due à des mutations dans des facteurs épigénétiques tels que TET2. La perte de la marque d’hétérochromatine H3K9me3, qui joue un rôle majeur dans la répression des éléments transposables (TE), induit un biais myéloïde. Les TE jouent un rôle crucial dans les réseaux de régulation génique. Nous émettons l'hypothèse que la perte d'hétérochromatine aux TE et l'altération de l'activité de facteurs de transcription (FT) pourraient participer au biais myéloïde dans la CHIP. Nous utiliserons le traçage de lignées pour identifier les origines cellulaires du biais myéloïde lors de la perte de TET2 et pendant l'inflammation chronique mimant le vieillissement. Le rôle enhancer des TE sera évalué par des approches multi-omiques étudiant l'ouverture de la chromatine, la méthylation de l'ADN et différentes marques d'histones aux TE dans les CSH et leurs progéniteurs dans ces conditions. En parallèle, nous utiliserons des modèles mathématiques pour générer des réseaux booléens de l'activité des facteurs de transcription (FT) dans ces cellules. Enfin, nous modulerons l’expression des FT pour valider la collaboration TE/FT dans les modifications du transcriptome et de la fonction des CSH et des progéniteurs myéloïdes. TECHROCHIP réunit trois partenaires ayant l'expertise nécessaire et complémentaire dans des approches de pointe et des modèles génétiques uniques afin de définir la fonction des TE en tant qu'activateurs de réseaux transcriptionnels induisant un biais myéloïde dans la CHIP. Ce projet pourrait révéler de nouvelles stratégies pour limiter ou prévenir les maladies inflammatoires liées à l'âge

Les néphrites interstitielles (NI) sont caractérisées par un infiltrat inflammatoire affectant l'interstitium et les tubules rénaux. Ces caractéristiques peu spécifiques ne permettent souvent pas d'identifier une étiologie particulière. Récemment, des cas de NI ont été décrits chez des patients atteints de myélodysplasie, maladie hématologique caractérisée par l'acquisition d'une hématopoïèse clonale (CH) de la lignée myéloïde. Cependant, cette CH acquise peut également survenir à l'état présymptomatique, en association avec le vieillissement. Outre le risque de transformation maligne, ces mutations ont été associées à des manifestations pro-inflammatoires, impliquant les cellules myéloides et l'immunité innée. Hypothèse: Certaines NI pourraient être liées à une infiltration directe du rein par des cellules porteuses de CH. Objectif: Comprendre le rôle physiopathologique de la CH au cours des NI. De façon préliminaires, nous avons identifié 38 patients avec NI et infiltrat à cellules myéloides, dont 84% avec un CH circulante. Chez 11/24 patients, des cellules clonales ont également été détectées dans l'échantillon de rein. Après revue histologique de biopsies rénales avec NI (138 cas avec ADN circulant disponible), nous rechercherons une CH dans le sang et le rein, et caractériserons la signature protéique (imagerie Hyperplex, Lunaphore), et les voies de signalisation (transciptomique spatiale, GeoMx, Nanostring) impliquées dans les Clon-IN chez l'homme. En outre, nous développerons des modèles murins de Clon-IN en exposant des souris avec CH à des lésions rénales. Nous comparerons les voies moléculaires impliquées dans les modèles murins et et chez les patients, pour proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant ces voies. Notre étude permettra de caractériser les Clon-IN, et de démontrer le lien direct entre clones circulants et infiltration rénale, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans ces pathologies.

Le vieillissement est l'un des principaux défis de santé publique. En ayant un impact sur la fonction des cellules souches hématopoïétiques (CSH), le vieillissement est fortement associé à un risque accru de développer des cancers et de nombreux autres troubles, tels que les maladies cardiaques, par le biais d'un déclin de l'immunité adaptative et de l’inflammation. Des altérations épigénétiques ont été observées dans les CSH âgées. L'altération de l'hétérochromatine dans les CSH s'accompagne d'une surexpression des éléments transposables (TE) et d'une augmentation de l'inflammation. Les TE peuvent modifier le transcriptome. Ils peuvent également être reconnus comme des parasites endogènes et induire une inflammation stérile. L'inflammation peut à son tour induire des altérations de l'hétérochromatine et de l'expression des TE et aggraver le phénotype des CSH dans un cercle vicieux. Nous émettons ici l'hypothèse que les altérations de l'hétérochromatine et des TE jouent un rôle central dans les altérations fonctionnelles des CSH et dans la production / fonction des cellules myéloïdes avec l’âge. Grâce à l'association de trois partenaires ayant des expertises complémentaires en épigénétique, biologie de la transcription, TEs et différenciation myélomonocytaire, nous explorerons si : 1/ les altérations de l'hétérochromatine et la dé-répression des TE sont des événements communs à l'âge et aux stress. 2/ la dé-répression des TE, via des altérations du transcriptome, est le moteur des changements fonctionnels des CSH et de leur capacité à produire des monocytes avec l'âge. 3/ les TE sont impliqués dans les propriétés inflammatoires des CSH et des monocytes âgés. 4/ ces voies peuvent être manipulées par reprogrammation pour rajeunir la fonction des CSH. Ce projet devrait permettre d'identifier des moyens de restaurer la fonction des CSH en manipulant l'hétérochromatine et l'expression des TE, contribuant ainsi à un vieillissement en meilleure santé.

Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) peuvent survenir suite à des néoplasmes myéloprolifératifs (NMP). Elles sont caractérisées par des anomalies de l'axe p53 dans la moitié des cas. La majorité des mutations de p53 correspondent à des mutations faux-sens, avec des effets gain de fonctions bien décrits dans les cancers solides mais actuellement débattus dans le domaine des LAM. Nous avons développé des modèles murins de LAM post-NMP porteurs de mutation motrice des NMP (JAK2V617F) associée à la perte ou à des mutations de p53 et avons observé des caractéristiques spécifiques associées aux mutants, en particulier une diminution de la survie due à une apparition plus précoce des LAM. Nous avons également montré, dans un autre travail, en utilisant des cellules primaires de patients et des modèles murins, que l’inflammation était importante dans la sélection des clones mutés p53 et la progression leucémique des NMP. L'objectif du projet est de déterminer les nouvelles fonctions associées aux mutants et comment elles peuvent conduire à la progression leucémique, ainsi que le rôle de l’inflammation dans cette progression. Nous utiliserons d'abord plusieurs techniques -omiques pour identifier de nouvelles voies et de nouveaux partenaires spécifiquement associés aux mutants. Ces analyses seront réalisées dans le compartiment des progéniteurs érythro-mégacaryocytaires (E/MK) car les cellules leucémiques s’amplifient au sein de ce compartiment. Les nouvelles voies, partenaires ou cibles identifiés seront validés ensuite par des études fonctionnelles in vitro et in vivo grâce à différents modèles déjà établis par l’équipe (lignées cellulaires, échantillons primaires humains, souris transgéniques, xénogreffes dérivées de patients). Nous déterminerons aussi comment les mutants de p53 peuvent être sélectionnés et conduire au développement de LAM dans un contexte NMP, sous l'effet de deux stimuli inflammatoires différents : le poly(I:C) qui mime la voie de l'IFN de type 1, et l'âge. En plus du phénotype des souris, nous étudierons l’instabilité génétique induite par l’inflammation ainsi que le transcriptome des progéniteurs E/MK dans les différents modèles. Notre étude permettra de comprendre les mécanismes physiopathologiques liés aux mutants de p53 dans les LAM, le rôle de l'inflammation dans ce processus et conduira à l’identification de nouvelles voies/nouveaux partenaires. Ces résultats pourraient être applicables à d’autres LAM secondaires mutées pour TP53 comme les LAM thérapies induites. Nos travaux pourront ainsi mener à améliorer le traitement des patients et le pronostic de ces maladies très graves.

The generation of ex vivo functional megakaryocytes (MK) and platelets is questioning current transfusion medicine exclusive reliance on blood donors to produce platelets. The demand for platelets is, in fact, in continuous rise, driven by an aging population, advances in medical procedures and even more aggressive cancer therapies, although the supply of blood donors continues to remain stagnant. Ex vivo platelet production systems have then emerged as a feasible supply that can moreover secure universal compatibility to avoid platelet refractoriness. If during the FET Open application we have proved that the platelet production ex vivo can be precision-tailored with the correct physical and biochemical environment, now with SilkPlatelet our consortium is looking forward to demonstrating the feasibility of an upscaled ex vivo production system. To bring then our technology from TRL4 to TRL6 we will increase the ex vivo platelet production capacity with media and stem cells aligned to GMP requirements for large-scale clinical transfusion. Our goal is to produce universal platelets particularly for patients with immune reaction to previous transfusions with HLA null platelets and patients with acute hemorrhage. At the core of our ?from lab-to-patients? roadmap, we will find both UNICAM proprietary technology to differentiate stem cells into MK precursors (natural source of platelets) and UNIPV disruptive bioreactor made of a silk-scaffold to mimic the bone marrow conditions. These will be then complemented by IGR long-term experience in iPSC and MK biology, and ISENET cell quality control contribute to the standardization of the platelet production pipeline and its validation and verification. Under the guidance of our experienced tech transfer officers, by the end of the project we expect to complete the transition into a commercial innovation exploited by a next university spin-out.

The 15-month coordination and support action “4.UNCAN.eu” will generate a strategic agenda to launch UNCAN.eu, a European initiative to UNderstand CANcer proposed by the Mission Board and the European Beating Cancer Plan. This research agenda will be built with the final aim of achieving a new breakthrough in cancer prevention and treatment that will contribute to saving European citizens’ lives and help ensuring an optimal quality of life to disease survivors. To reach a new level of understanding, UNCAN.eu will take advantage of recent advances in research data generation and data sciences. Reliable, high-quality cancer research data generated by experimental model analysis and collected from longitudinal follow-up of cancer patients will be shared and integrated at an unprecedented scale within a Federated Cancer Research data hub, in the context of the General Data Protection Regulation. This information will be used by relevant players in Europe and beyond to address urgent and essential scientific and medical challenges in cancer prevention, early diagnosis, treatment and survivorship, in males and females of various ages. These challenges, identified in close interaction with European patients and citizens, will be tackled through competitive, ambitious and innovative, cross-border and trans-disciplinary research programmes built in a problem-solving manner. The definition of challenges will integrate inequalities in cancer research across regions and member states in order to boost the research potential of less-developed regions in Europe. Players will be committed to open science principles, including FAIR (findable, accessible, interoperable, and reusable) guiding principles for scientific data collection, management and stewardship. The new understanding gained from the collection and analysis of this wealth of data will apply secondarily to other diseases.

Les mégacaryocytes (MK) sont de grandes cellules polyploïdes produisant les plaquettes et jouent un rôle essentiel dans le maintien du microenvironnement de la moelle osseuse (MO). Une dérégulation de la formation des MKs peut conduire à des néoplasmes myéloprolifératifs (NMP), à une thrombocytémie et à une myélofibrose (MF) associée, avec un risque accru de complications thrombotiques et d'insuffisance médullaire. Une mutation acquise de JAK2V617F, entraînant une signalisation constitutive du récepteur Mpl de la thrombopoïétine, est la cause principale de la plupart des NMP. Bien que les inhibiteurs ciblant les molécules de signalisation clés en aval de Mpl, tels que JAK2, MEK et PI3K, aient montré un bénéfice thérapeutique dans le traitement des NMP, ils n'aboutissent pas à une rémission complète et n'ont aucun effet sur la MF. Il est donc urgent de mieux comprendre comment la signalisation Mpl est régulée et d'identifier de nouvelles cibles médicamenteuses. L'hypothèse du projet REMYS est que les tyrosine phosphatases Shp1 et Shp2 jouent des rôles critiques dans la régulation de la signalisation Mpl et que leur ciblage peut avoir des avantages thérapeutiques. Un ensemble de données a déjà établi que Shp1 et Shp2 travaillent conjointement pour réguler la signalisation Mpl, le nombre et la fonction des MK dans la MO et les plaquettes sanguines. En utilisant une ensemble de techniques de pointe multidisciplinaires et de nouveaux modèles de souris, nous déchiffrerons les mécanismes moléculaires qui permettent à Shp1 et Shp2 de contribuer au maintien de l'homéostasie des MK/plaquettes ; les conséquences physiopathologiques de leur délétion dans la lignée MK dans un modèle murin de NMP/MF, et le bénéfice thérapeutique de l'inhibition de Shp2. Les données permettront une compréhension accrue des mécanismes moléculaires régulant la mégacaryopoïèse et la thrombopoïèse et de révéler de nouvelles cibles améliorées pour le traitement du NMP et de la MF.

Les défauts moléculaires lors de la mégacaryo(MK)poïèse, processus de la production plaquettaire, peuvent entraîner une thrombocytopénie (héréditaire -TH ou acquise). Parmi les TH, les macrothrombocytopénies héréditaires (macroTH) sont souvent caractérisées par des mutations de gènes impliqués dans la réorganisation du cytosquelette. Nous nous intéresserons ici aux macroTH impliquant l’axe GPIb/GPIX/GPV-vWF: le Syndrome Bernard Soulier avec des mutations dans GP1BB, GP1BA et GP9 et une diminution/absence du complexe GPIb/GPIX/GPV à la surface d'une part, et la maladie de von Willebrand de type 2B et la maladie de von Willebrand de type plaquettaire avec mutations de gain-de-fonction dans respectivement VWF et GP1BA, d'autre part. L’objectif principal est de comprendre le rôle de l’axe GPIB complexe-vWF en tant qu’intégrateur central de la signalisation au cours de le MKpoïèse afin de comprendre comment différents types de mutations dans les mêmes gènes conduisent à un phénotype proche et d’améliorer la stratification des patients en ciblant les voies de signalisation dérégulées.

Nous avons montré récemment que les patients infectés par le SARS-CoV-2 qui développent une forme sévère de la maladie accumulent dans le sang et les alvéoles pulmonaires des cellules anormales de l’immunité innée, incluant des polynucléaires neutrophiles immatures de phénotype CD10low CD101- CXCR4+/- et des monocytes classiques CD14+ CD16- HLA-DRlow (Silvin et al, Cell 2020). Nous avons aussi détecté la disparition précoce des monocytes non-classiques CD14low CD16+ circulants et la présence, dans le plasma du sang périphérique, de quantités très importantes de l’hétérodimère S100A8/S100A9, aussi connu sous le nom de calprotectine, ces deux anomalies constituant des marqueurs des formes sévères de la COVID-19. L’élévation de la calprotectine circulante a été confirmée par plusieurs groupes indépendants comme un prédicteur du risque de forme sévère de la COVID-19. La détection de ces marqueurs a été mise en place dans certains laboratoires de routine hospitalière afin de détecter précocement les patients à risque susceptibles d’évoluer vers une maladie sévère et souvent fatale. Le décès de la COVID-19 a été associé à divers facteurs de prédisposition au premier plan desquels l’âge, diverses comorbidités et des facteurs génétiques. Parmi les patients atteints de cancer, les plus fragiles sont ceux qui ont une histoire récente d’hémopathie maligne, lesquels ont un risque de COVID-19 fatale 2,5 fois plus élevé que la population normale. Nous avons identifié une corrélation entre un taux élevé de calprotectine circulante et une hématopoïèse d’urgence générant des cellules myéloïdes immunosuppressives et pro-thrombotiques chez les patients atteints de COVID-19 sévère mais la contribution de ce médiateur soluble à l’initiation et à l’amplification de cette hématopoïèse de stress restait méconnue. Le projet proposé a pour but d’explorer plus précisément les mécanismes physiopathologiques impliqués dans l’hématopoïèse d’urgence observée chez les patients atteints de COVID-19 sévère et d’explorer les caractéristiques et les capacités de différenciation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (CSPHs) de patients atteints d’une hémopathie maligne en réponse à la calprotectine. Notre hypothèse est que ces cellules souches malignes ont une capacité accrue à générer des cellules de l’immunité innée dysplasiques et des mégacaryocytes pro-thrombotiques en réponse à la calprotectine. Nous déterminerons la capacité de la calprotectine à induire une réponse myéloïde immunosuppressive et pro-thrombotique au niveau de la CSPH et identifierons le ou les récepteurs impliqués dans cet effet. L’identification des effets de la calprotectine et des récepteurs impliqués au niveau de la CSPH pourrait suggérer des approches thérapeutiques capables de contrôler la boucle de rétrocontrôle toxique entre cellules matures et immatures du système hématopoïétique qui se met en place dans les formes les plus sévères de la COVID-19.

Le syndrome de Shwachman-Diamond (SDS) et les neutropénies congénitales (NC) SDS-like liées à une anomalie du complexe SRP (signal recognition particle) sont caractérisées par un défaut de maturation de la lignée granuleuse et une apoptose des granulocytes neutrophiles et de leurs précurseurs. Ces pathologies sont dues à des altérations génétiques de SBDS, SRP54 et SRP68 affectant respectivement la maturation des ribosomes et l’adressage des protéines dans le réticulum endoplasmique (RE). Une fonction clé des neutrophiles est la synthèse de protéines avec un rôle anti-infectieux qui sont empaquetées dans des granules. Les ribosomes et le RE ont un rôle majeur dès le stade promyélocytaire de la granulopoièse au cours duquel débute la synthèse des granules. Des altérations de l’axe ribosome/RE peuvent conduire à des défauts de synthèse, d’adressage, de maturation et de conformation des protéines. Nos résultats préliminaires et récemment publiés sur SBDS, SRP54 et SRP68 ont mis en évidence un stress accru du RE, une activation de l'UPR et une apoptose P53-dépendante des cellules granulocytaires. Le projet vise trois objectifs: 1) étudier l’impact des anomalies de SBDS et de SRP sur l’homeostasie du RE à chaque étape de la différenciation granulocytaire et tester des inhibiteurs du stress du RE, 2) caractériser les mécanismes moléculaires responsables du stress du RE et identifier les protéines affectées par un défaut de SBDS ou du complexe SRP et, 3) identifier de nouvelles entités génétiques de NC SRP-like. Le projet est divisé en 3 workpackages scientifiques (WP). Dans le premier WP, nous analyserons la viabilité cellulaire, le cycle cellulaire, la sénescence et l’apoptose, en particulier dépendante de P53, à chaque étape de la granulopoïèse à partir de cellules primaires de patients et de shARN. Nous étudierons au niveau transcriptionel et protéique les mécanismes d’induction du stress du RE au cours de la granulopoièse. Nous réaliserons des tests in vitro avec des molécules chaperones restaurant l'homéostasie protéique. Enfin, les patients avec un SDS et une NC lié à un défaut du complexe SRP, pouvant présenter une anémie et/ou une thrombopénie, nous étudierons également les lignées érythrocytaire et mégacaryocytaire. Dans le second WP, nous utiliserons trois approches complémentaires pour disséquer les mécanismes moléculaires du stress du RE induit par les mutations SBDS et SRP. Nous réaliserons des transcriptomes à l’échelon unicellulaire dans les progéniteurs granulocytaires en utilisant une technologie innovante combinant le scRNA-seq et le CITE-seq. Nous ferons du profilage des ARN ribosomaux pour déterminer les anomalies des pauses ribosomales connues pour affecter la dégradation co-traductionnelle de l’ARNm et de la chaîne naissante. Enfin, nous ferons de la protéomique pour savoir quelles protéines sont dérégulées ou mal transloquées dans le ER. Dans le troisième WP, nous réaliserons le séquençage génome complet couplé au séquençage ARN afin de rechercher de nouvelles entités génétiques parmi les 30% de NC restant sans étiologie moléculaire. Le projet inclut deux équipes, qui ont une expertise importante et complémentaire dans l’étude de l’hématopoïèse, du stress du RE, des analyses RNAseq sur cellule unique et de génomique. Le projet s'appuiera également sur le registre français des NC qui effectue un recueil exhaustif des données cliniques en relation avec une biobanque centralisée et, sur la collaboration avec deux équipes de recherche avec une expertise d’une part sur l’étude du stress du RE et d’autre part, sur le profilage ribosomique. En conclusion, nous devrions considérablement améliorer nos connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables du stress du RE et de l’activation de l’UPR dans la granulopoïèse et sur les protéines affectées dans le SDS et les NC liées à SRP. L'identification de nouveaux gènes pourrait révéler de nouvelles voies physiopathologiques impliquées dans les NC.

Comprendre comment l'exposition aux rayonnements ionisants (IR) induit un vieillissement prématuré et installe un état pré-leucémique est un problème majeur de santé publique. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) génèrent toutes les cellules du sang. Le maintien de leur intégrité est donc crucial. Les CSH sont particulièrement sensibles aux IR, utilisées notamment lors des radiothérapies. L’IR induit des défauts similaires à l’âge dans les CSH : l'accumulation de dommages à l'ADN, la perte d'auto-renouvellement et une différenciation biaisée vers la lignée myéloïde conduisant à une augmentation du nombre de cellules myéloïdes et à un déclin de la réponse immunitaire adaptative. Ceci contribue probablement au développement de pathologies liées à l’âge et au risque élevé de développer des néoplasmes myéloïdes suite aux thérapies (t-NM). Les t-NM sont associés à un taux de survie très faible et constituent l'une des conséquences les plus dévastatrices des traitements anti-cancéreux. C’est devenu une préoccupation majeure au cours des dernières années, car le nombre de survivants des traitements anticancéreux ne cesse d'augmenter, accroissant l'incidence des t-NM. Cependant, les mécanismes régissant la perte de fonction des CSH suite aux IR sont inconnus. L'IR induit des cassures double brin (CDB) de l’ADN. Il est généralement admis que les lésions de l'ADN sont à l’origine du vieillissement. Cependant, un lien direct entre CDB et perte de fonction des CSH n’a pas été établi. D'autre part, il a été démontré que l'IR induit des altérations épigénétiques dans différents tissus. Les facteurs épigénétiques sont des régulateurs clés de la fonction des CSH et sont souvent mutés dans les leucémies. Ces mutations augmentent également avec l'âge chez des individus en bonne santé, où elles confèrent une hématopoïèse clonale. Les défauts épigénétiques pourraient donc être à l’origine de la perte de fonction des CSH et du développement des leucémies. Des altérations de l'hétérochromatine, qui réprime l'expression des éléments rétrotransposables (RTE), ont été rapporté au cours de l’âge. Les RTE sont des séquences répétées qui peuvent se propager dans le génome par un mécanisme de copier/coller. Ils constituent une grande source d'instabilité génomique. L'expression incontrôlée des RTE est également impliquée dans des altérations majeures du transciptome. Récemment, nous avons montré que les RTE sont surexprimés suite aux IR. L'équipe a également montré que l'expression des RTE augmente avec l'âge dans les CSH murines et humaines. Cependant, l'impact de la dérépression de RTE sur le transcriptome et la fonction des CSH est inconnu. Nous proposons d'explorer l’hypothèse selon laquelle l'IR affecterait directement l'hétérochromatine des CSH. Les altérations de l'hétérochromatine, en libérant des RTE, modifieraient le transcriptome et seraient à l’origine de la perte de fonction des CSH et de l'établissement d'un état préleucémique. Les mutations perte de fonction du gène Tet2 font partie des mutations les plus fréquentes lors du vieillissement, dans l'hématopoïèse clonale, ou dans les leucémies, et sont associées à un risque accru de t-NM. Nous proposons également d'étudier l’impact de la perte de fonction de TET2 sur l’hétérochromatine des CSH et l’expression des RTE. Nous étudierons enfin l'hypothèse selon laquelle les altérations de l'hétérochromatine induites par l'IR et la perte de fonction de TET2 pourraient coopérer pour déréguler de façon synergique des gènes et/ou RTE communs et/ou différents, augmentant et accélérant le risque de développer des t-NM. Ce projet de recherche devrait fournir de nouvelles pistes sur les mécanismes impliqués dans la perte de fonction des CSH lors de l'IR ou du vieillissement, et le développement des t-NM. L'objectif final de ce projet est l’identification de voies pouvant être ciblées sur le plan thérapeutique pour atténuer les effets des thérapies génotoxiques et du vieillissement.