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Par séquençage d’exome d’une famille avec agrégation de formes très sévères de spondylarthrite ankylosante (SA) nous avons mis en évidence un variant rare faux sens du gène BbSp porté par les membres de la famille ayant la forme sévère de la maladie. L'acide aminé correspondant est très conservé chez les mammifères, attestant son importance fonctionnelle. Bbsp est impliqué dans le métabolisme osseux et nous souhaitons confirmer son rôle causal dans les ossifications de la SA par i) séquençage d’exome de 200 patients avec une forme sévère de SA ii) étude phénotypique au scanner et en histologie d'un modèle animal de souris portant la même mutation du gène BbSp murin; nous rechercherons des ossifications du rachis et des enthèses iii) l'utilisation d'un modèle de culture cellulaire de chondrocytes et d’ostéoblastes issus de ces souris pour comprendre les conséquences fonctionnelles de cette mutation sur leur maturation et sur leurs fonctions cellulaires.

Les traitements de la colite ulcéreuse (CU) se sont considérablement améliorés ces dernières années, mais de nombreux patients ne répondent pas ou développent des résistances. Il y a donc un besoin urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques guidées par des biomarqueurs. Les cils primaires (CP) sont un important centre de signalisation des cellules, et nous avons été les premiers à identifier leur rôle dans le côlon. Notamment, nous avons trouvé un défaut de cils primaires dans les régions enflammées des biopsies de patients de CU. Maintenant nous caractériserons (1) les cellules du côlon exprimant ces cils et (2) les altérations moléculaires qui résultent de leur perte, par des approches de protéomique et RNAseq sur des modèles murins. Enfin, nous vérifierons si les cils primaires et les mécanismes identifiés peuvent servir de biomarqueur sur les biopsies de patients atteints de CU.

La COVID-19 est une infection virale aiguë liée au SARS-CoV-2 (Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus de type 2) pouvant comporter différents symptômes. Le SARS-CoV-2 infecte les pneumocytes de type II en se liant à l’enzyme de conversion de type 2 (ACE-2) membranaire. En plus de l’atteinte pulmonaire, la Covid-19 affecte d’autres localisations, dont les artères et veines de petit et gros calibre en raison de la forte expression de l’ACE2 dans les cellules endothéliales (CE) et les péricytes (PC). Les thromboses de gros vaisseaux, notamment artériels, est devenue caractéristique de cette maladie et liée à une surmortalité. L’évaluation post-mortem de patients Covid-19, malgré son caractère limité, a mis en évidence une véritable endothéliite multi-viscérale, avec une mort cellulaire endothéliale et la présence de particules virales dans les CE. Dans le même sens, une infection directe de l’endothélium par le virus, une inflammation endothéliale diffuse, et une thrombose intravasculaire ont été observées dans le tissu pulmonaire de patients décédés de la Covid-19. L’ensemble de ces observations implique donc fortement l’endothélium vasculaire dans la pathogenèse de la Covid-19. Nous proposons de combiner l’expertise de trois équipes reconnues dans le domaine de la (dys)fonction endothéliale afin de décrire les lésions vasculaires provoquées par l’infection au SARS-CoV-2 dans les vaisseaux artériels de petit, moyen et gros calibre, en comparaison avec l’infection au virus de la grippe, en combinant les études morphologiques, cellulaires, moléculaires et génétiques en condition préclinique chez la souris, et sur échantillons humains. Nous utiliserons deux modèles. Les échantillons humains d’artères de petit, moyen et large calibre (capillaires musculaires, artères radiales et fémorales) provenant de patients décédés de Covid-19 seront obtenus, avec l’autorisation de l’Agence de la Biomédecine. En parallèle, des lignées de souris humanisées exprimant le récepteur hACE2 spécifiquement dans les cellules endothéliales et dans les péricytes seront générées en croisant des souris CKI-hACE2 obtenues, avec respectivement des souris Cdh5-CreERT2 et NG2-CreERT2 déjà disponibles dans notre laboratoire, et seront infectées par voie nasale. Le premier objectif est de réaliser une analyse cellulaire et moléculaire des altérations vasculaires morphologiques liées à l’infection au SARS-CoV-2, basée sur l’histologie, l’immuno-histochimie, et l’imagerie avancée intravitale et posmortem, ainsi que l’exploration fonctionnelle endothéliale in vivo et in vitro. Enfin, une analyse moléculaire extensive des vaisseaux infectés devrait déterminer la signature moléculaire de l’infection. Le deuxième objectif est d’explorer le rôle spécifique des CE et des PC dans l’infection de la paroi vasculaire et son altération, en utilisant une analyse morphométrique à différents stades de l’infection chez la souris, et sur les échantillons humains, associée aux explorations in vivo et in vitro cellulaire et moléculaire de l’implication des péricytes. Le troisième objectif est de décrire le statut des voies protectrices de l’endothélium pendant le processus infectieux. Nous nous focaliserons sur le Glycocalyx, le facteur Desert Hedgehog Dhh, un effecteur de Klf2 dont nous avons démontré l’effet protecteur endothélial en pathologie ischémique, et la voie du monoxyde d’azote. Le 4ème objectif est d’évaluer les capacités réparatrices des inhibiteurs de la sérine protéase et l’antithrombine, qui ont été suggérés de façon déductive comme molécules candidates puisqu’ils inhibent la TMPRSS2 et ainsi la voie d’intégration du virus . Comme les agonistes du Dhh dans l’objectif 3, nous proposons leur utilisation sur le nouveau modèle de souris humanisée. Ce projet fournira pour la première fois une analyse approfondie cellulaire et moléculaire, morphologique et fonctionnelle, de l’endothélium et de son arsenal protecteur pendant l’infection au SARS-CoV-2.

Peu de gènes sont impliqués dans les dysgénésies thyroïdiennes (DT) à l’origine de l’hypothyroïdie congénitale (HC) touchant 1/3000 nouveau-nés. Récemment, nous avons identifié un nouveau gène TUBB1 impliqué dans les HCDT. TUBB1 code pour un isotype de ß-tubuline, un des éléments constitutifs des microtubules (MT), et fortement représenté dans les plaquettes. Nous avons montré qu’une altération des MT pouvait perturber le développement thyroïdien et l’activation des plaquettes. Nous émettons l'hypothèse que d'autres composants du cytosquelette, tels que les autres isoformes de tubuline et leurs modifications post-traductionnelles pourraient affecter le développement et la physiologie de la thyroïde, ainsi que la fonction des plaquettes. Notre projet élucidera cette hypothèse en analysant l’organisation des MT et leurs mécanismes dans le développement de la thyroïde, la sécrétion des hormones thyroïdienne et la fonction des plaquettes via des modèles in vivo et in vitro déjà établis.

L’augmentation des contraintes mécaniques cardiaques aboutit à des adaptations fonctionnelles et éventuellement structurelles du myocarde lorsque le stress mécanique persiste. La répétition de ces contraintes mécaniques peut conduire à un remodelage physiologique du cœur, comme cela est observé en réponse à l’exercice physique. Néanmoins, lorsque ce stress devient chronique, il peut conduire à un remodelage défavorable associé à des incohérences fonctionnelles et ainsi au développement d’une pathologie cardiaque. À ce jour, le principal traitement permettant de limiter l’apparition d’un remodelage cardiaque délétère consiste à réduire la surcharge de pression. Par conséquent, il semble essentiel d’améliorer la compréhension des voies de signalisation impliquées dans la réponse fonctionnelle et structurelle du cœur à l’augmentation des contraintes de charges ventriculaires. En réponse à l'étirement, le myocarde augmente sa production d'oxyde nitrique (NO). Jusqu'à récemment, la signalisation du NO était considérée comme étant liée à l'activation de la voie impliquant la protéine kinase dépendante de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) (voie NO-GMPc-PKG). Cependant, le NO peut également moduler la signalisation cellulaire en se fixant directement et de manière covalente aux résidus cystéines de protéines, un processus appelé S-nitrosylation (SNO). Ce second mécanisme a été moins étudié et est au centre du projet NitrosoCard. La SNO est une modification post-traductionnelle réversible majeure impliquée dans la régulation de l'activité des protéines et permettant aussi de les protéger d’une oxydation irréversible. Ce processus a été bien décrit dans les mitochondries où il est associé à une moindre production d’espèces réactives de l’oxygène et à une cardio-protection. Les myofilaments cardiaques sont bien décrit comme étant sensibles aux phénomènes de signalisation redox et, sont par conséquent, potentiellement sensibles à la SNO. Néanmoins, à ce jour le rôle de la SNO dans la régulation de la machinerie contractile cardiaque demeure non élucidé. Dans le projet NitrosoCard, nous émettons l'hypothèse qu’un stress d’étirement cardiaque est à l’origine d’une translocation de la signalisation endothéliale NO-synthétase (eNOS) -SNO vers les myofilaments, permettant de réguler leurs propriétés contractiles. Lorsque le stress d’étirement myocardique devient trop important et chronique, cette signalisation cellulaire devient défectueuse et pourrait contribuer à expliquer le développement à plus long terme d'une réponse pathologique du cœur. Les objectifs du projet NitrosoCard sont d'élucider le rôle de la SNO des protéines sarcomériques en réponse à un stress d'étirement en condition physiologique ou pathologique. Notre hypothèse sera testée à travers trois objectifs originaux permettant une approche de l'animal entier jusqu’à l'échelle moléculaire. Le projet NitrosoCard aura comme objectif d’évaluer 1- l’impact du stress d’étirement myocardique sur la translocation de la signalisation eNOS/NO/SNO vers les myofilaments ; 2- l’impact direct ou indirect de la SNO sur la fonction de la machinerie contractile en réponse à un étirement myocardique ; et enfin 3- si la répétition (activité physique) ou la chronicité (pathologie) des stress d’étirements myocardiques aboutissent à différents profils de S-nitrosylation des protéines de la machinerie contractile et ainsi à différents profils de réponses adaptatives du cœur. Le projet NitrosoCard devrait permettre d'identifier de nouvelles voies de signalisation redox-dépendantes impliquées dans la réponse physiologique du cœur à une situation de stress. La perte de cette signalisation dépendante du NO pourrait jouer un rôle clé dans la transition vers un remodelage pathologique du cœur. L’identification de ces mécanismes pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles moléculaires cruciales pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques.

L'épithélium intestinal est un tissu en constant renouvellement qui s'adapte rapidement à son environnement. Le microbiote et les cellules immunitaires, au contact direct des cellules épithéliales intestinales, peuvent avoir un impact sur leurs fonctions et ainsi moduler l'absorption des nutriments, la sécrétion des entérohormones et la fonction de barrière du tractus gastro-intestinal. Cette triade constitue donc une cible intéressante pour prévenir ou combattre la pandémie mondiale d'obésité. Ainsi, les procédures de chirurgie bariatrique ont montré leur efficacité contre l'obésité et les troubles métaboliques associés. Les techniques chirurgicales les plus couramment utilisées en France sont la sleeve gastrectomie verticale (VSG) et le bypass gastrique Roux-en-Y (RYGB). Au-delà de la diminution de la prise alimentaire et de la surface d'absorption, différents mécanismes ont été rapportés pour expliquer leurs effets bénéfiques : modifications de la sécrétion des entérohormones (dont l'incrétine GLP-1), augmentation de l'absorption intestinale du glucose, modifications de la composition du microbiote. De façon surprenante, les cellules immunitaires intestinales sont encore peu caractérisées après ces chirurgies. Nous posons l’hypothèse que les cytokines produites par les cellules immunitaires intestinales (CII) sont des médiateurs clés du dialogue entre les cellules immunitaires et les cellules épithéliales intestinales (CEI), contrôlant l'adaptation intestinale en réponse à la chirurgie bariatrique et que les métabolites dérivés du microbiote modulent ce dialogue à trois. Les objectifs de ce programme de recherche sont de caractériser le phénotype et les fonctions des CII en réponse à la chirurgie bariatrique (tâche 1), leurs relations avec le microbiote et ses métabolites (tâche 2) et le rôle des CII et du microbiote dans la reprogrammation des CEI (tâche 3). Nous nous concentrerons sur les adaptations intestinales post-chirurgie dont nous avons déjà établi l’importance clinique à savoir : l’augmentation du nombre des cellules entéroendocrines (CEE) et notamment des cellules sécrétrices de GLP-1 après VSG et RYGB et le changement du métabolisme du glucose en relation avec l'hyperplasie de l’anse alimentaire après RYGB. Afin d'étudier le rôle potentiel des CII dans ces adaptations nous travaillerons sur des modèles précliniques (Tâches 1-3) mais aussi sur une cohorte de sujets obèses, candidats à la chirurgie bariatrique (Tâche 4). La force du consortium "Ménage À Trois Intestinal" (IMAT) est de réunir des chercheurs et cliniciens ayant une expertise complémentaire et synergique en physiopathologie intestinale (Partenaires 1-3), obésité & chirurgie bariatrique (Partenaire 1), immunologie intestinale (Partenaire 2) et microbiote (Partenaire 3). Les perspectives de ce travail sont d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques intestinales, donc accessibles par voie orale, modulant l'épithélium, l'immunité et/ou le microbiote intestinal afin de prévenir ou limiter les effets néfastes de l'obésité ou alternativement d'induire les mêmes conséquences bénéfiques que la chirurgie bariatrique tout en limitant ses effets négatifs.

La drépanocytose est une maladie génétique héréditaire récessive causée par une substitution Glu->Val dans la chaîne β-globine (βS) entraînant l’expression d’une hémoglobine anormale (HbS) qui polymérise en conditions hypoxiques provoquant la falciformation du globule rouge (GR) et la réduction de sa demi-vie. La drépanocytose est une maladie multisystémique sévère caractérisée par une anémie hémolytique, une forte susceptibilité aux infections, une inflammation, des crises vaso-occlusives douloureuses récurrentes et des atteintes organiques. Elle est également caractérisée par une érythropoïèse de stress, avec des anomalies pendant la phase terminale de la différenciation érythroïde, suggérant que des défauts médullaires pourraient contribuer à l’anémie. Nous avons récemment démontré l’existence d'une dysérythropoïèse dans la moelle osseuse de patients drépanocytaires et en avons décrit un mécanisme moléculaire impliquant la séquestration cytoplasmique de la protéine chaperonne HSP70 par des polymères d’HbS. Bien que la drépanocytose soit étudiée depuis des décennies, elle reste une pathologie complexe nécessitant des efforts constants pour mieux l’appréhender et pour développer de nouveaux traitements dans une perspective de médecine personnalisée. Les principaux traitements ciblent l'HbS, avec l’objectif (i) de réduire ses quantités dans la circulation, en transfusant les patients ou en les greffant avec des cellules souches hématopoïétiques, ou (ii) d’interférer avec sa polymérisation, en induisant l’expression de l'hémoglobine fœtale (HbF) à l'aide de l’hydroxycarbamide (HC). L’HC a été testée pour la première fois dans la drépanocytose il y a plus de 35 ans, mais ses mécanismes d’action induisant l'HbF restent encore mal élucidés. L'HbF est un modulateur clé de la pathologie drépanocytaire car elle inhibe la polymérisation de l'HbS, prolongeant ainsi la demi-vie des GR. En plus de ses effets bénéfiques connus, nous avons récemment révélé un nouveau rôle pour l’HbF lors de la différenciation érythroïde terminale en montrant qu'elle protégeait les érythroblastes acidophiles, polychromatiques et orthochromatiques, de l’apoptose induite par la polymérisation de l’HbS. Nous avons construit un projet ambitieux pour étudier les mécanismes moléculaires à l’origine de la dysérythropoïèse dans la drépanocytose et pour tester l'effet de différents traitements sur la différenciation érythroïde. En particulier, notre projet IRIS s’intéressera (i) aux bases moléculaires de la dysérythropoïèse liées à l'auto-oxydation de l'HbS et au déséquilibre d’association entre la chaîne α et la chaîne βS, et (ii) à l'impact de la mort cellulaire des érythroblastes acidophiles sur la niche érythroïde, en particulier sur le macrophage central de l'îlot érythroblastique. Nous développerons également des stratégies thérapeutiques innovantes basées sur l'édition génétique et évaluerons leurs effets, ainsi que ceux d’autres molécules thérapeutiques telles que l’HC, sur la dysérythropoïèse. Notre étude sera menée in vitro et in vivo, à l’aide d’un large panel d'outils et de matériel humain comprenant des cellules hématopoïétiques primaires de patients et des lignées cellulaires développées pour les besoins du projet, ainsi que les souris transgéniques humanisées Townes. Le projet IRIS explore de nouveaux aspects de la physiopathologie de la drépanocytose, tant au niveau fondamental que translationnel. Il contribuera à la caractérisation de dysfonctionnements cellulaires au cours du processus de fabrication des GR, et apportera des éléments pour mieux appréhender la variabilité interindividuelle en terme d’expression clinique de la maladie, notamment en ce qui concerne le degré de l’anémie. Ce projet aboutira également au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques susceptibles d'améliorer l'espérance de vie et la qualité de vie des patients, et par conséquent de réduire les coûts des traitements chroniques dans cette pathologie.

La maladie de Willebrand (MW) est une maladie hémorragique congénitale provoquée par des défauts quantitatifs ou qualitatifs en facteur Willebrand (FW) une protéine plasmatique jouant un rôle clé dans la formation du thrombus plaquettaire lors de l’hémostase primaire. Malgré les traitements, la qualité de vie des patients atteints de MW est significativement altérée. Les traitements actuels, basés sur le remplacement de la protéine manquante (type sévère de MW) ou sur la sécrétion de stocks endothéliaux (types modérés ou qualitatifs de la MW) ne prennent pas en compte l’hétérogénéité de la pathologie ni les mécanismes moléculaires spécifiques à des sous-groupes de patients. Il apparait clairement que la prise en charge de la MW doit être améliorée, en particulier pour les femmes qui sont plus atteintes du fait des challenges gynécologiques. Nous avons deux objectifs principaux: 1) Mesurer de manière objective le poids de la MW en termes de santé publique en croisant les données du Centre de Référence de la MW avec celles du Système National des Données de Santé (SNDS) qui regroupe toutes les données de l’assurance maladie. Dans une première partie, cette approche sera orientée vers les femmes afin de cerner le poids de la MW en prenant en compte les hospitalisations, interventions chirurgicales, consommation de médicaments, visites gynécologiques, arrêts de travail, et autres paramètres. Ceci nous permettra d’identifier le pourcentage de patientes qui malgré un diagnostic bien établi et une prise en charge standard de leur pathologie, sont toujours sujettes à des épisodes hémorragiques. Dans un second volet, nous nous focaliserons principalement sur les patients chez lesquels une clairance accélérée du FW est soupçonnée et nous comparerons les trajectoires hémorragiques individuelles avec un calcul de la demi-vie du FW. La mise en évidence d’une corrélation nous permettra d’identifier une population cible qui serait susceptible de bénéficier d’une prise en charge plus personnalisée et dans ce cas précis, d’une approche thérapeutique visant à prolonger la demi-vie du FW. 2) Ce dernier point sert de lien avec notre deuxième objectif qui est de développer de nouvelles pistes thérapeutiques pour la MW, fondées sur l’identification des besoins cliniques non couverts qui auront été mis en évidence ou confirmés par notre premier objectif. Nos approches sont basées d’une part sur l’utilisation de de fragments d’anticorps à domaine unique (nanobodies) ou d’autre part sur des nanoparticules mimant les plaquettes. Ainsi en nous basant sur notre connaissance du catabolisme du FW, nous allons générer des nanobodies bispécifiques qui viseront à augmenter la concentration plasmatique du FW. Une autre série de nanobodies bispécifiques sera développée avec pour but de promouvoir ou de normaliser l’activité pro-hémostatique de variants dysfonctionnels du FW. Tous les projets «nanobodies» s’appuient sur une plateforme totalement opérationnelle au sein du consortium et sur des nanobodies déjà partiellement obtenus. Une approche alternative sera basée sur la bioingéniérie de particules lipidiques décorées de peptides bioactifs mimant la fonction des plaquettes sanguines. Ces particules ayant démontré leur efficacité hémostatique dans des modèles de trauma seront testés dans un sous-type particulier de MW caractérisé par un défaut de la fonction plaquettaire. Des modèles murins dédiés de la MW ainsi que des approches biochimiques seront utilisés pour tester ces différentes approches. Notre projet est un projet de rupture concernant la MW, une maladie hémorragique souvent négligée mais qui impacte significativement la vie des patient(e)s. Nous nous appuyons sur une expertise importante sur les aspects cliniques et fondamentaux de la MW, des modèles d’études disponibles, des résultats préliminaires importants et une autorisation d’accès au SNDS déjà obtenue.

La protéine kinase AMPc-dépendante (PKA) est un régulateur physiologique majeur de la fonction cardiaque. Dans le cœur adulte, la PKA est responsable des effets cardiotoniques d’une stimulation β-adrénergique (β-AR) aiguë, mais son activation chronique est délétère, ce qui suggère que la PKA pourrait être une cible intéressante dans l'insuffisance cardiaque (IC). À l'état inactif, la PKA est un hétérotétramère composé de deux sous-unités régulatrices (R) qui lient et inhibent deux sous-unités catalytiques (C). Lors d’une stimulation β-AR, l'AMPc se lie aux sous-unités R, ce qui entraîne l'activation des sous-unités C. Deux types de PKA, type I et type II, varient en fonction de leurs sous-unités R, respectivement RIα et RIIα. Alors que la PKA de type II a été impliquée dans la contraction cardiaque, le rôle de la PKA de type I est mal compris. En effet, chez la souris, le knock-out global ou spécifique des cardiomyocytes de RIα augmente l'activité de la PKA et provoque une létalité embryonnaire en raison d'un défaut de développement cardiaque. Chez l'homme, des mutations inactivatrices hétérozygotes du gène PRKAR1A entraînant une haplo-insuffisance de RIα provoquent le Complexe de Carney (CNC), une maladie endocrinienne rare associée à des myxomes cardiaques à l'origine d'une morbi-mortalité élevée. Les myxomes cardiaques sont des lésions bénignes d'origine sous-endocardique dont les cellules ne sont pas clairement identifiées. Les myxomes cardiaques du CNC ont été associés à des malformations cardiaques congénitales, suggérant leur origine développementale. Sur la base de ces informations, les deux objectifs de ce projet sont i) de déterminer les conséquences de l'inactivation de RIα dans le cœur de souris adulte et dans du tissu cardiaque artificiel humain et ii) de déchiffrer le rôle de la PKA de type I dans la morphogenèse cardiaque précoce et la myxomagenèse. Pour cela, les partenaires de ce projet ont développé de nouveaux modèles de souris Cre/Lox avec invalidation de RIα spécifiquement dans différents lignages cardiaques et inductible dans les cardiomyocytes. Le séquençage de l'ARN de noyaux uniques permettra de caractériser l’identité cellulaire d’une collection unique de myxomes. Afin de modéliser le CNC et d'explorer l'impact d’une haploinsuffisance de RIα dans la cardiogenèse et la myxomagenèse humaines, nous reprogrammeront des cellules mononuclées de sang périphérique de patients porteurs d'une mutation inactivatrice de PRKAR1A en cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) et les différencieront en différentes lignées cardiaques, y compris les cardiomyocytes (hiPSC-CM), la crête neurale et les cellules musculaires lisses vasculaires. En outre, les cellules hiPSC-CM seront utilisées pour reconstituer des tissus cardiaques humains en collaboration avec T. Eschenhagen (Allemagne). Nos résultats préliminaires indiquent que l'invalidation de RIα dans les cardiomyocytes chez les souris adultes active la PKA et entraîne une IC progressive, tandis que la délétion dans les cellules de la crête neurale cardiaque entraîne une létalité partielle au jour embryonnaire 15,5 associée à des défauts du tronc artériel et du septum. Le programme de travail prévu permettra d'approfondir ces phénotypes notamment par l’analyse transcriptomique, afin de déterminer comment RIα contrôle le déploiement des cellules progénitrices pendant l'embryogenèse et d'identifier de nouveaux gènes impliqués dans le remodelage pathologique du cœur adulte. L'identification des cellules composant les myxomes ouvrira la voie à la compréhension des mécanismes de la myxomagenèse chez l'homme. L'utilisation de tissu cardiaque humain reconstitué permettra d’approcher pour la première fois la fonction de la PKA de type I dans le cœur humain. L’ensemble de ces résultats permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels l'activation chronique de la PKA pourrait favoriser les cardiopathies congénitales, les myxomes cardiaques et l'IC.

Des polymorphismes dans les gènes de l’autophagie qui conduisent à une autophagie dérégulée, le régime alimentaire occidental ainsi qu’une colonisation anormale de la muqueuse iléale par des E. coli adhérents et invasifs (AIEC) ont été révélés comme des facteurs de risque de la maladie de Crohn (MC). Ce projet vise à (i) étudier l’effet du régime alimentaire occidental sur l'autophagie, (ii) examiner l’impact de la combinaison du régime alimentaire occidental et de la susceptibilité génétique de l’hôte (autophagie dérégulée) sur l’homéostasie intestinale, le microbiote intestinal et la défense contre les AIEC, et (iii) identifier les espèces bactériennes et leurs métabolites qui pourraient exercer des effets bénéfiques sur l’homéostasie intestinale via la modulation de l'autophagie. Ainsi, ce projet contribuera à une meilleure compréhension de l'étiologie de la MC et, à l’avenir, au développement de thérapies personnalisées basées sur la modulation de l’autophagie.

Les prions sont des pathogènes neurotropes présentant un risque majeur pour la santé en raison de leur potentiel zoonotique et iatrogène. Les mécanismes de réplication et de dissémination du prion, qui s’appuient uniquement sur le mépliement et l’agrégation auto-entretenue de la protéine prion de l’hôte restent peu décrits. Notre objectif est de modéliser ces processus en se basant sur les avancées récentes selon lesquelles les agrégats de prions sont structuralement hétérogènes et dynamiques et non uniformes et statiques. Nous cartographierons de manière spatiotemporelle dans un cerveau infecté la diversification structurelle des assemblages prion en relation avec leur activité biologique et leur toxicité afin de construire un modèle mathématique multi-échelle de diversification du prion et de propagation des lésions. Ce modèle en libre accès sera capable de prédire la progression de la maladie et d'identifier des processus élémentaires clés pour la thérapie et le diagnostic précoce.

Le RSV est un agent majeur et ubiquitaire des infections virales respiratoires chez l’Homme. Il est responsable de plus de 33 millions de cas/an de bronchiolite chez l’enfant. Chez l’adulte, les infections par le RSV sont responsables d’une morbidité et d’une mortalité proche de celles de la grippe, touchant essentiellement les sujets âgés ou fragilisés. Il n'existe ni vaccins ni antiviraux spécifiques contre le VRS. Le développement de traitements spécifiques représente donc un enjeu de santé publique prioritaire, et dépend pour partie d’une meilleure connaissance des mécanismes moléculaires de réplication virale. La réplication de génome viral et la transcription des ARNm du VRS ont lieu au sein d’inclusions cytoplasmiques (IBs) qui sont de véritables usines virales. Ces structures clés restent à l’heure actuelle des "boîtes noires". De nombreuses questions restent sans réponse concernant leur organisation et leur fonctionnement : Comment leur structure détermine-t-elle leurs fonctions clés (régulation de la synthèse de l'ARN viral, encapsidation, tri des ribonucléoprotéines virales et des ARNm) ? Quels sont les mécanismes de leur biogenèse ? Quelles sont les protéines cellulaires recrutées au sein de ces usines virales ? La formation de condensats par séparation de phase apparaît comme un nouveau principe pour expliquer l'organisation des cellules vivantes. Récemment, il a été démontré que les usines virales du VRS comme celles d’autres virus ANR négatif simple brin présentaient les propriétés d’organelles liquides formées par séparation de phase. Le présent projet vise à élucider les mécanismes de biogénèse des usines du VRS et à progresser vers la compréhension de leurs relations structure-dynamique-fonction en revisitant ces questions clés dans le cadre des modèles de séparation de phase. Pour ce faire, nous avons réuni des compétences complémentaires et distinctes au sein de notre consortium. Nous revisiterons l'assemblage et la dynamique des IBs du VRS en combinant plusieurs systèmes modèles dans une approche interdisciplinaire : IBs en cellules infectées par des virus recombinants, pseudo-IBs résultant de l’expression transitoire de protéines virales ou IBs reconstitués in vitro à partir de protéines recombinantes. Nous identifierons les protéines cellulaires recrutées au sein des IBs en s’appuyant sur un modèle d’IBs artificiels assemblés en cellules. Les modifications post-traductionnelles (PMT) sont des éléments clés de la régulation des propriétés des organelles liquides. Nous identifierons les PMT des protéines virales et analyserons leur impact sur les propriétés et les fonctions des IBs dans nos différents modèles. Notre objectif est de définir les éléments qui contrôlent l’assemblage des IBs et d’identifier les mécanismes qui régulent leurs propriétés, leur organisation et leur fonctionnement. L'élucidation de la biogenèse, de la composition et du fonctionnement de ces compartiments clés dans la multiplication du VRS ouvrira la voie au développement de nouveaux antiviraux pour le traitement des infections par le VRS qui représentent un problème majeur de santé publique.

L'activation de la voie NF-kB s’accompagne d’une régulation coordonnée de la transcription de centaines de gènes cibles, la majorité étant impliquée dans la différenciation cellulaire, la prolifération, la réponse immunitaire, et l'inflammation. Il a été récemment proposé que des structures nucléaires appelées usines à transcription NF-kB coordonnent, dans l’espace et le temps, la transcription de plusieurs gènes répondeurs à NF-kB. Cependant, les mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces contacts gène-gène, ainsi que leurs impacts sur d'autres processus couplés à la transcription restent inconnus. L'infection par HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus type 1) s’accompagne d’une activation constitutive de NF-kB qui contribue à l'expansion clonale des cellules infectées, la persistance virale, et la pathogenèse. Nos travaux ont récemment mis en évidence que, en dehors de la transcription, l'activation de NF-kB par la protéine virale TAX affecte également l'épissage alternatif, un processus cotranscriptionnel majeur dans la diversité du transcriptome et du protéome. En présence de TAX, ou même d'autres activateurs non viraux de NF-kB, nous avons démontré que l’enrichissement intragénique de RELA entraîne un recrutement local du facteur d'épissage DDX17 qui régule l'épissage des exons par à son activité hélicase à ARN. De manière intéressante, RELA apparait réguler l'épissage alternatif de manière indépendante de son activité sur la transcription, ce qui pose la question des mécanismes de coordination de ces deux fonctions de RELA lors de l'activation de NF-kB par TAX, ou par d’autres stimuli non-viraux. Via une analyse intégrative de la topologie 3D de la chromatine et des profils d'expression des gènes, nos données préliminaires indiquent que l'activation du NF-kB par TAX favorise les contacts gène-gène entre les gènes subissant une régulation de la transcription et de l'épissage alternatif. La perturbation locale des contacts gène-gène par manipulation épigénétique permettait d’inhiber le recrutement de DDX17 à l'exon et son épissage alternatif. Au niveau de la chromatine, les contacts gène-gène étaient enrichis en RELA, DDX17 et TAX, suggérant l’engagement de ces facteurs dans la formation de complexes multigéniques. Les analyses de données publiques montrent que les exons génomiques régulés par RELA:DDX17 portent des signatures épigénétiques qui pourraient participer à coordonner les contacts gène-gène, l'élongation de la transcription, et l'épissage alternatif lors de l'activation de NF-kB. Ces premières données proposent que l'épissage alternatif ne repose pas uniquement sur des caractéristiques génomiques et épigénétiques locales de l'exon cible, mais dépend également de sa localisation nucléaire avec d'autres gènes co-régulés en transcription. Nous avons mis en place une collaboration entre nos deux équipes sur la base de l’expertise du HTLV-1 et de ses impacts sur les régulations post-transcriptionnelles (F. Mortreux), et celle des mécanismes qui relient l'épigénétique à la régulation de l'épissage alternatif (RF. Luco). Nos objectifs sont d'évaluer la distribution chromatinienne de RELA, DDX17, TAX et des marques d'histones dans les contacts gène-gène liés à l'épissage alternatif, d'examiner l'implication locale des régulateurs d'histones et des protéines d’architecture de la chromatine, et d'étudier les relations causales qui relient les contacts gène-gène et les marques d'histones à l'épissage alternatif survenant lors de l'activation de NF-kB par TAX ou d’autres inducteurs non viraux. Ces données informeront sur les modes de coordination spatiale de la transcription des gènes et de l'épissage alternatif lors de l'activation de NF-kB, qui est un aspect mal compris de la régulation des gènes lors de l'infection par HTLV-1 et, de manière plus générale, dans les maladies inflammatoires.

Ce projet vise à révéler des mécanismes neuronaux favorisant une récupération motrice après une lésion de la moelle épinière. Plus spécifiquement, il étudiera la plasticité et l’importance fonctionnelle de voies neuronales descendantes en provenance du tronc cérébral. Les lésions médullaires conduisent à des pertes très invalidantes des fonctions motrices et sensorielles en dessous de la lésion qui peuvent inclure la perte de la marche. Cette condition, encore incurable, résulte de l'interruption ou l'affaiblissement des voies neuronales qui interfacent le cerveau et la moelle épinière. Pour autant, les circuits de la moelle épinière déafférentés peuvent produire une activité nerveuse locomotrice s'ils sont activés de manière adéquate, même longtemps après la lésion. De manière tout autant encourageante, les axones sectionnés peuvent montrer une capacité à se ramifier ou à repousser et les stratégies visant à promouvoir cette plasticité semblent très prometteuses. Pour être pertinentes cliniquement, il est cependant crucial que ces stratégies i) ne soient pas aveugles à l'origine (spinale ou supra-spinale), l'identité moléculaire (neurotransmetteur, identité génétique), la directionnalité (ascendante ou descendante) et la fonction des voies axonales ciblées, et ii) soient rapidement applicables à l’homme. D'une part en effet, les données sur des animaux non lésés, auxquelles nous avons contribué, ont révélé que le déclenchement de la marche repose sur des sous-types bien définis de (mais pas sur tous les) neurones glutamatergiques et sérotoninergiques du tronc cérébral postérieur qui projettent vers la moelle épinière. D'autre part, nous avons récemment démontré les bénéfices sur la récupération des fonctions sensori-motrices et à l'infiltration axonale au travers de la lésion de la stimulation magnétique trans-spinale répétitive (rTSMS), une forme non-douloureuse et non invasive de stimulation focalisée du système nerveux applicable à l’homme. Malgré ces avancées, il existe encore un manque flagrant de transversalité entre la recherche fondamentale et préclinique. D’un côté, les voies descendantes pertinentes pour la locomotion sont encore peu étudiées dans des contextes post-lésionnels et leur capacités de repousse restent mal caractérisées. De l’autre, les stratégies régénératives, y compris la rTSMS, sont encore souvent aveugles à la nature des voies axonales dont la connectivité est renforcée. S’appuyant sur notre combinaison d’expertises et nos études préliminaires, nous examinerons ici la plasticité et la contribution fonctionnelle à la restauration motrice, à la fois spontanée et favorisée par la rTSMS, des voies descendantes identifiées dans contextes non lésés comme principal substrat à l'initiation locomotrice. Nous mettrons en œuvre, chez la souris, une sélectivité sans précédent pour le marquage et la manipulation de l'activité de ces neurones descendants suite à une lésion expérimentale réaliste par contusion. Sur cette base, nous suivront 3 objectifs principaux afin: 1) de caractériser la plasticité post-SCI (ramification, régénération et connectivité des axones) de chaque voie descendante de manière sélective, en utilisant la microscopie conventionnelle et l'imagerie volumétrique. 2) de démontrer la causalité entre la plasticité anatomique et la récupération locomotrice. Pour cela, nous utiliserons des outils d'interférence optogénétiques et chémogénétiques ciblés à un type de neurone descendant et combinés à une caractérisation fine des fonctions motrices. 3) d’étudier comment la rTSMS influe sur, et comment ses bénéfices fonctionnels sont soutenus par, la plasticité et l’activité de chacune des voies descendantes étudiées. Nos efforts combinés décriront ainsi un schéma de connectivité anatomo-fonctionel propice à la récupération motrice. Ils préciseront aussi des processus neuronaux qui sous-tendent les bénéfices d’une forme prometteuse de thérapie régénérative transposable à l’homme.

Depuis trente ans, les études sur la protéine précurseur d’amyloid (APP) se sont en priorité focalisées sur la synaptotoxicité d’un de ses fragments, le peptide amyloid-ß (Aß), dans la maladie d’Alzheimer. Or, APP, clivée de façon physiologique, permet la sécrétion d’Aß mais aussi d’autres peptides, dont le peptide Amyloid-ƞ (Aƞ) décrit par le collaborateur externe (CE) Allemand de ce projet (Dr Willem) et le partenaire 1 (P1) (Willem et al. 2015). Ce peptide est formé grâce au clivage d’APP par l’ ƞ-secretase et semble altérer la communication synaptique et l’activité calcique. Ce projet propose d’élucider une question majeure non-résolue: quel est le rôle de ce peptide Aƞ sécrété de façon physiologique dans le cerveau? Les données préliminaires du travail collaboratif entre les trois partenaires de ce projet et CE Allemand permettent de formuler l’hypothèse qu’Aƞ représente un modulateur de l’activité des récepteurs glutamatergiques NMDA (NMDARs). Cette modulation semble modifier le traitement d’information dépendant des NMDARs ainsi que les tâches cognitives et comportementales associées. Partant de ces données, nous proposons de disséquer la nécessité et l’impact d’Aƞ dans le cerveau. Nous avons réuni un consortium d’experts d’Aƞ (P1 et CE Allemand), de l’analyse des NMDARs (P1 et P2), du comportement chez la souris (P1 et P3) et de l’analyse de la fonction synaptique liée au calcium (CE Anglais). Le projet est divisé en trois tâches (T): T1- Identification du mécanisme par lequel Aƞ module les NMDARs. T2- Identification de l’impact d’Aƞ sur la gestion d’information dépendante du calcium et des NMDARs. T3- Identification de l’impact d’Aƞ sur les tâches cognitives et comportementales dépendantes des NMDARs. Nous disposons de peptides synthétiques et recombinants d’Aƞ. Nous avons créé un modèle murin sur-exprimant une version sécrétée d’Aƞ dans le cerveau (modèle MISEPA2) et un modèle murin dans lequel le clivage d’APP par ƞ-secretase a été abolit engendrant une absence d’Aƞ (modèle APPDƞ). Pour T1, nous analyserons comment Aƞ module l’activité des NMDARs après application aiguë de ces peptides sur ovocytes de xénopes, sur neurones en culture, sur tranches d’hippocampe des souris contrôles et grâce à l’analyse des 2 nouveaux modèles murins. Dans cette T1, nous utiliserons les techniques d’électrophysiologie de patch, de fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM), de traçage du mouvement des NMDARs par quantum dot et une analyse biochimique pour respectivement identifier l’impact d’Aƞ sur les courants, la conformation, le ‘trafic’ des NMDARs, et une interaction directe entre Aƞ et les NMDARs. Pour T2, nous analyserons l’impact d’Aeta sur la dynamique du calcium à la synapse par imagerie calcique 2-photon sur cultures de neurones et aussi par couplage d’électrophysiologie de patch, d’imagerie calcique 2-photon et du décageage de glutamate sur tranches d’hippocampe. Nous utiliserons l’éléctrophysiologie de champ et de patch pour disséquer l’impact d’Aƞ sur la plasticité synaptique et l’intégration du signal synaptique liés aux NMDARs. Pour T3, nous soumettrons les lignées MISEPA2 et APPDƞ et leurs contrôles respectifs à des tâches cognitives et comportementales dépendantes des NMDARs pour identifier comment la modification des niveaux d’Aƞ in vivo impacte les processus mnésiques, l’anxiété et la sociabilité. S’éloignant de l’analyse classique des peptides issus d’APP en conditions pathologiques, ce travail appréhendera avec précision la fonction de ce nouveau peptide Aƞ dans le cerveau en condition physiologique afin de le classer comme un nouveau modulateur essentiel de la signalisation neuronale. Il sera ensuite possible d’évaluer comment des modifications pathologiques de bioactivité et de quantité de ce peptide contribuent aux dysfonctionnements synaptiques et cognitifs observés dans la maladie d’Alzheimer et possiblement dans d’autres désordres psychiatriques liés aux NMDARs.

La neurogenèse est le processus qui forme le tissu neural fonctionnel par la différenciation des cellules souches en neurones, oligodendrocytes et cellules gliales. La neurogenèse a lieu dans des niches ventriculaires spécifiques et commence pendant l'embryogenèse, atteint un maximum au début du développement. à l'âge adulte. elle est encore présente dans des régions restreintes. Les neurones nouveau-nés migrent vers le site d'intégration, se différencient en neurones matures et s'intègrent dans les circuits fonctionnels déjà établis. En utilisant la larve de poisson zèbre, un modèle idéal pour l'édition du génome et l'imagerie calcique des grands circuits neuronaux, nous avons récemment montré que dans le toit optique de la larve, les cellules souches neuroépithéliales se différencient en neurones nouveau-nés qui seront poussés passivement vers les sites d'intégration. Là, ces neurones immatures vont d'abord générer des connexions instables et faibles avec les inputs pré-synaptiques arrivant de la rétine. Ces connexions initiales permettent des épisodes d'activité synchrone entre les neurones nouveau-né et les neurones fonctionnellement matures, ce qui facilite l'augmentation de la force synaptique et la stabilisation des synapses entre les deux. Ce processus favorise ensuite l'intégration fonctionnelle des neurones nouveau-nés dans des sous-réseaux neuronaux fonctionnellement matures et l'acquisition de leur identité fonctionnelle. Cette étude a décrit pour la première fois chez un vertébré en développement, les interactions fonctionnelles entre les neurones nouveau-nés et les circuits matures durant le processus d'incorporation. Cependant, les mécanismes neuronaux sous-jacents du processus d'intégration restent élusifs et on encore ignore comment ces processus peuvent contribuer à la réparation des dommages cérébraux. Pour répondre à ces questions ouvertes, nous utiliserons la larve de poisson-zèbre, l'édition génomique, l'imagerie Ca2+ bi-photonique, et l'optogénétique pour surveiller et manipuler (exciter ou inhiber) l'activité des neurones nouveau-nés et celle des circuits accueillant, chez un vertébré en développement, intact, non anesthésié, non paralysé. Ces expériences seront réalisées dans des conditions normales, chez des larves présentant des lésions cérébrales précises et après greffe de neurones nouveau-nés. Profitant de cette approche multidisciplinaire, rendue possible par la collaboration complémentaire entre Sumbre et Joly, nous nous proposons d'étudier les objectifs suivants : Objectif 1. Le rôle de l'activité des neurones nouveau-nés dans le processus d'incorporation. Nous utiliserons l'optogénétique pour manipuler leur activité pendant le processus d'incorporation. Objectif 2. Le rôle de l'expérience sensorielle dans l'intégration des neurones nouveau-nés. Nous utiliserons l'expérience visuelle (stimulation visuelle répétitive) pour manipuler l'activité des circuits accepteurs. Objectif 3. Recrutement des neurones nouveau-nés suite à une lésion cérébrale. Nous surveillerons l'activité des neurones nouveau-nés suite à des ablations cérébrales petites et précises. Nous espérons que nos résultats jetteront une lumière nouvelle sur le dialogue fonctionnel entre les neurones nouveau-nés et le réseau neuronal mature pendant le processus d'incorporation, et sur son rôle dans la réparation du cerveau.La compréhension de ces principes fonctionnels pourrait ouvrir la voie à l'amélioration de nouveaux traitements à base de cellules souches pour la réparation du cerveau dans les maladies neurodégénératives ou les traumatismes cérébraux, en augmentant la précision et le taux d'incorporation tout en réduisant le risque d'effets secondaires associés à de mauvais schémas de connectivité.

Les synucléinopathies englobent notamment la maladie de Parkinson, la démence à corps de Lewy et l’atrophie multi-systématisée (MSA). Ces maladies se caractérisent par une accumulation d’agrégats protéiques enrichis en alpha-synucléine (asyn) agrégée sous forme fibrillaire dans le cerveau des patients. Au cours du temps, les inclusions d’asyn progressent dans le cerveau suivant un chemin stéréotypé. Cependant, les populations cellulaires et les régions cérébrales affectées ainsi que la progression spatiale des inclusions au fil du temps diffèrent suivant les synucléinopathies. L’asyn joue un rôle clé dans les synucléinopathies. L’asyn pathologique se propage à la manière de prions dans le cerveau, un mécanisme sous-tendant (au moins partiellement) la progression spatiale des agrégats d’asyn au fil du temps. Toutefois, nous ignorons comment la même protéine, via un processus de propagation identique, peut affecter différentes populations cellulaires et conduire à des maladies avec des manifestations cliniques et des lésions histopathologiques distincts. Ainsi, les mécanismes responsables de la propagation sélective des agrégats d’asyn à différentes populations cellulaires restent incompris. De plus, les oligodendrocytes sont spécifiquement affectés dans la MSA. Ils n’expriment pourtant pas ou très peu d’asyn. Nous ignorons donc d’où provient l’asyn qui contribue à la formation des inclusions cytoplasmiques oligodendrogliales dans la MSA. L’asyn fibrillaire existe sous différentes conformations capables de transmettre leurs caractéristiques aux protéines d’asyn nouvellement recrutées, constituant ainsi des souches transmissibles. In vivo, ces souches induisent la formation de divers types d’inclusions se propageant différemment dans le cerveau en fonction de leur conformation. Ainsi, ces souches pourraient contribuer à l’hétérogénéité des synucléinopathies. Il est important de souligner que les fibres d’asyn interagissent avec les protéines présentes à la membrane des cellules et dans leur cytosol lors de leur internalisation et leur propagation. Ces interactions jouent un rôle crucial dans l’internalisation et l’amplification des fibres dans la cellule hôte. Avec leurs différentes conformations, les souches d’asyn exposent au solvant et à leur environnement protéique différents résidus. Ainsi, les souches d’asyn possèdent des interactomes protéiques distincts qui affectent la propagation de type prion de manière différente suivant les populations cellulaires concernées. Enfin, il est certain que le quantité d’asyn disponible dans le cytoplasme de la cellule hôte est cruciale pour l’amplification des souches. Par conséquent, nous pensons que le tropisme et la sélectivité des agrégats d’asyn pour différentes populations cellulaires dans les synucléinopathies sont dus à des interactions souches-spécifiques avec des protéines membranaires et cytosoliques, et dépendent de la disponibilité de l’asyn monomérique pour son recrutement. Pour explorer ces hypothèses, nous identifierons les partenaires protéiques souches-spécifiques impliqués dans la propagation de l’asyn pathologique dans différentes populations neuronales et oligodendrogliales. Nous déterminerons ensuite le rôle exact de ces partenaires protéiques dans la propagation des souches d’asyn en culture cellulaire et in vivo. De plus, nous identifierons l’origine de l’asyn formant les inclusions cytoplasmiques oligodendrogliales, et déterminerons si des sous-populations oligodendrogliales sont plus susceptibles de développer des inclusions et pour quelle raison. Notre travail permettra d’identifier les partenaires protéiques pouvant être modulés afin de réduire ou bloquer l’internalisation et l’amplification de l’asyn pathologique. A terme, nos résultats conduiront vers de nouvelles stratégies thérapeutiques pouvant s’adapter au patient en fonction des synucléinopathies afin de réduire la propagation des agrégats d’asyn et leurs conséquences délétères.

Chaque année, les infections fongiques invasives (IFI) sont responsables de plus de 1,6 million de décès dans le monde, un taux de mortalité égal à celui de la tuberculose et supérieur à celui du paludisme. Malgré les divers antifongiques disponibles, la mortalité associée aux IFI reste élevée en raison de facteurs liés à l'hôte, de l'efficacité insuffisante des drogues, de leur toxicité et de l'émergence de souches résistantes à ces antifongiques. Il devient urgent de trouver de nouvelles alternatives pour combattre les pathogènes fongiques. Le développement des connaissances en immunobiologie des pathogènes fongiques a permis d’explorer des approches immunothérapeutiques. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour lutter contre les IFI dont la stimulation de l'immunité cellulaire par le biais de l’augmentation du nombre/de l'activation des cellules immunitaires innées. Cependant, la faible durée de vie de ces cellules ne permet pas d'obtenir des défenses à long terme. L'administration de cellules T adaptatives spécifiques peut offrir une défense à long terme contre les IFI. Toutefois, la sélection des antigènes fongiques stimulant les cellules T et le contrôle de l'expansion des cellules T spécifiques restent à établir. L'immunisation passive à base d'anticorps, qui renforce l'immunité humorale, est prometteuse. Des anticorps monoclonaux dirigés contre la paroi cellulaire fongique offrent une protection contre les IFI dans les modèles animaux mais reste de courte durée. Un vaccin thérapeutique ou prophylactique est une alternative, mais à ce jour, aucun vaccin contre les pathogènes fongiques n’a été développé. Le principal défi de la formulation d'un vaccin antifongique reste l’identification des antigènes adéquats. Les drogues antifongiques et anticorps monoclonaux utilisés en clinique ou modèles animaux d'infection fongique ciblent principalement la membrane/paroi cellulaire fongique, montrant qu’elle est une cible idéale. La paroi fongique est composée de différents polysaccharides (CW-PS). Malgré le potentiel prometteur des CW-PS, leurs applications thérapeutiques ont été peu explorées à cause de leur faible immunogénicité, leur insolubilité et leurs propriétés d'agrégation. Néanmoins, quelques vaccins à base de CW-PS fongiques ont montré une protection partielle sur des modèles animaux. La paroi cellulaire fongique est une structure dynamique dont la composition en polysaccharides varie au cours de la croissance et de l’environnement, ceci suggère la nécessité de cibler plusieurs CW-PS. Sur la base de nos expertises pluridisciplinaires en immunologie fongique, glycobiologie et chimie pharmaceutique, nous proposons de surmonter ces inconvénients et d’exploiter les différents CW-PS pour développer de nouvelles approches immunothérapeutiques contre les IFI. Utilisant d'Aspergillus fumigatus comme modèle pathogène, nous identifions les épitopes immunogènes (oligosaccharides) des différents CW-PS, les conjuguerons avec une protéine porteuse et grefferons ces glycoconjugués sur des microcapsules. Cette approche permettra de surmonter l'insolubilité des CW-PS, leur agrégation et le couplage à une protéine-porteuse les rendra plus immunogénique. Nous avons l'intention de greffer des microcapsules avec des glycoconjugués dérivés de différents CW-PS afin de modéliser la paroi cellulaire fongique dans états dynamiques, qui devrait permettre une protection maximale contre les IFI. Certains CW-PS étant communs aux différentes espèces fongiques, les microcapsules greffées avec des glycoconjugués dérivés de ces CW-PS fourniront une protection antifongique à large spectre. D'autre part, les glycoconjugués pourront également être utilisés directement pour développer des anticorps monoclonaux qui seront utiles pour l'immunisation passive contre les IFI. Les connaissances générées par ce projet sur les propriétés immunologiques des CW-PS fongiques seront essentielles au développement de nouvelles approches immunothérapeutiques.

L'amylose AL est une maladie rare mais dévastatrice causée par le dépôt dans les organes et les tissus de fibrilles amyloïdes composées d'une chaîne légère (CL) d'immunoglobuline monoclonale. Malgré des études biochimiques approfondies et de nombreuses études cliniques, la physiopathologie de cette maladie reste encore mal comprise en raison de l'absence d'un modèle animal fiable. Nous avons récemment déterminé pour la première fois les conditions pour reproduire l'amylose AL dans un modèle de souris transgénique propriétaire. Dans ce présent projet, nous utiliserons ce modèle animal original et unique pour mieux comprendre les événements menant à la formation de fibrilles in vivo, la toxicité intrinsèque des CL amyloïdes et les effets sur différents processus biologiques tels que les anomalies de l'hémostase. Nous utiliserons également ce modèle pour valider deux approches complémentaires visant à éliminer les dépôts d’amylose AL dans les organes.

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative encore incurable, apparaissant sous une forme silencieuse bien avant les premières démences. Identifier un biomarqueur-cible précoce pourrait ouvrir la voie à l’identification de nouvelles fenêtres thérapeutiques et/ou au développement de traitements préventifs. Parmi les évènements susceptibles de sous-tendre précocement l’apparition de la MA, la neuroinflammation est un candidat sérieux. Nous avons récemment identifié un nouvel axe de régulation neuroinflammatoire sous le contrôle de la Transgelin 3 (TAGLN3). Nos données in vitro ont ainsi pu montrer que TAGLN3 est une protéine significativement sous-exprimée dans des astrocytes humains porteurs du facteur de risque génétique APOE4. Nos travaux ont ainsi mis en évidence que la sous-expression de TALGN3 dans les astrocytes est sous-jacente à la mise en place de dysfonctionnements inflammatoires importants tels qu’une inflammation chronique de bas grade et une exacerbation des réponses inflammatoires. Par ailleurs, une sous-expression de TAGLN3 a également été confirmée dans des échantillons de cerveaux de patients diagnostiqués pour la MA. Nos travaux ont aussi démontré que la modulation de TAGLN3 peut prévenir des mécanismes pro-inflammatoires pathogéniques dans les astrocytes. Ensemble, nos récentes données suggérent que cibler l’activation de TAGLN3 dans les astrocytes pourrait constituer une cible moléculaire et un type de cellule d’intérêt majeur dans le cadre de nouveaux développements pour des stratégies thérapeutiques anti-inflammatoires ciblées dans la MA. Suite à nos récentes découvertes, TAGLN3 apparait comme : 1) un possible biomarqueur précoce de dysfonctionnements inflammatoires sous-jacents la MA ; et 2) une cible thérapeutique pouvant agir sur des dysfonctionnements inflammatoires sous-jacents le développement/la progression de la MA. Ainsi, nous proposons un projet qui va s’articuler autour de trois sous-objectifs : i) évaluer le potentiel de TAGLN3 comme biomarqueur précoce de la MA ; ii) tester une approche de thérapie génique dans des modèles murins, en ciblant la Tagln3 astrocytaire; et iii) mettre en place une plateforme de criblage de molécules pour cribler et identifier des molécules stimulant l’expression de TAGLN3 dans des astrocytes humains. Pour atteindre ces ambitieux objectifs, notre projet va s’appuyer sur les expertises complémentaires de trois partenaires pour mener nos objectifs en parallèle. Ce projet va mettre en œuvre une méthode particulièrement sélective d’analyse en spectrométrie de masse sur des échantillons de patients (LCR, plasma) pour valider TAGLN3 comme un possible biomarqueur dans la MA. Par ailleurs, en s’appuyant sur des méthodes de transfert génique, nous allons chercher à moduler l’expression de la Tagln3 dans deux modèles de souris qui récapitulent certains des symptômes de la MA retrouvés chez l’homme. Cette stratégie de thérapie génique visera à établir une preuve de concept montrant que TAGLN3 peut être ciblée pour moduler la réactivité astrocytaire et prévenir/ralentir le développement de certains symptômes de la MA. Enfin, en nous appuyant sur notre expertise en matière de cellules reprogrammées à la pluripotence (iPS), nous allons établir une stratégie de criblage de molécules sur des astrocytes humains issus d’iPS pour cribler une librairie de molécules afin d’identifier des structures chimiques candidates capables de stimuler l’expression de TAGLN3. A la fin de ce projet, nous envisageons que TAGLN3 pourrait représenter une nouvelle cible de choix avec des usages multiples, diagnostiques et thérapeutiques, afin d’apporter de nouvelles possibilités dans la lutte contre la MA.

Bien que prometteuse, l’immunothérapie ciblant PD-1 n’est efficace que chez une fraction de patients et les mécanismes associés à la résistance ne sont pas élucidés. En effet, les tumeurs utilisent d’autres voies pour échapper aux lymphocytes T CD8 en particulier la perte des TAP. Nous avons identifié un néoépitope non-muté issu de la ppCT apprêté par une voie indépendante des TAP. Nous avons développé aussi une immunothérapie active fondée sur des peptides ppCT permettant de contrôler des tumeurs qui ont tenté d’échapper à l’immunité T CD8. Notre objectif est de valider une immunothérapie combinant le vaccin ppCT à anti-PD-1. Nous l’optimiserons en caractérisant des peptides longs et entreprendrons une étude toxicologique. Nous identifierons de nouveaux néoépitopes non-mutés issus de séquences "signal" de protéines produites par des tumeurs ayant répondu à anti-PD-1 et exprimant faiblement TAP. Nous examinerons leur implication dans cette réponse avant de les inclure dans le vaccin.

Les maladies neuromusculaires correspondent à un vaste groupe de troubles qui touchent collectivement 160 personnes sur 100000 dans le monde. Malgré des progrès récents, une grande partie de ces maladies sont toujours incurables. L’identification de nouveaux traitements est confrontée à la disponibilité d’outils de criblages pertinents ainsi que par la compréhension incomplète des mécanismes physiopathologiques, bien que les mutations et les gènes responsables de ces maladies aient été identifiés. En effet, à ce jour, le taux de réussite de produits thérapeutiques qui arrivent sur le marché est extrêmement faible. La plupart des candidats médicaments sont retirés à diverses étapes du processus de découverte et de développement pour des raisons d’innocuité ou de formulation, de mauvaises propriétés de l’ADME et de manque d’efficacité à la clinique. Plusieurs paramètres peuvent expliquer ce taux d’attrition élevé : (1). L’utilisation de modèles cellulaires non pertinents pour les campagnes de criblage pharmacologique ; (2). L’utilisation d’approches de découverte de médicaments ciblées dans lesquelles le point de départ est une cible moléculaire choisie pour jouer un rôle central dans la maladie. Cependant le rôle exact de ces cibles moléculaires n’est souvent pas bien compris dans le développement physiopathologique et ne prend pas en compte la complexité de ce développement. Par conséquent, l’un des défis essentiels pour l’identification de futures approches thérapeutiques réside dans l’établissement de modèles plus prédictifs et capable de saisir la complexité biologique de la maladie. Illustrant parfaitement ces limitations, la Dystrophie Myotonique de type 1 est l’une des formes les plus courantes de dystrophie musculaire chez l’adulte pour laquelle il n’existe aucun traitement curatife malgrè le fait que la mutation causale ait été identifiée il y a plus d’une trentaine d’années. Même si des pistes thérapeutiques ont été développées ces dernières années visant la présence de cette mutation, aucune n’a abouti actuellement démontrant l’intérêt de développer des modèles plus prédictifs capables de saisir la complexité biologique de la maladie. Dans ce contexte, le consortium TREAD propose de combiner l’utilisation de modèles cellulaires pertinents pour la pathologie avec une approche de criblage à large échelle basée sur de l’imagerie à haut contenu et de l’intelligence artificielle. De façon plus spécifique, TREAD vise à identifier des composés potentiellement thérapeutiques de par leur capacité à normaliser les défauts myogeniques observés chez les patients DM1 et qui peuvent être reproduits in vitro à l’aide de cellules musculaires. Le projet TREAD combinera l’utilisation de cellules souches humaines, porteuses de la mutation causale de cette pathologie, différenciées en cellules musculaires avec un criblage par imagerie à haut contenu basé sur des approches multiparamétriques et l’intelligence artificielle pour identifier de nouveaux traitements. Dans l’ensemble, notre proposition a plusieurs objectifs (1) identifier et optimiser de nouveaux composés capables de normaliser les défauts myogéniques associés au DM1, (2) déchiffrer leur mode d’action (3) valider leur action in vivo et (4) fournir une technologie de pointe qui accélérera le développement de thérapies pour la liste croissante de maladies neuromusculaires. Notre objectif final sera de convertir le meilleur candidat médicament identifié par cette approche en un produit applicable aux patients. En conclusion, notre proposition offre une occasion véritablement novatrice d’aller au-delà des limites des modèles actuels et promet d’ouvrir un nouvel espace majeur de développement d’essais en améliorant notre compréhension des mécanismes qui affectent le muscle squelettique DM1, d’identifier les modulateurs spécifiques à ces maladies musculaires d’origine génétique et d’offrir une plateforme pouvant être appliquée à un large éventail de domaines de recherche.

L'anémie de Fanconi (AF) est un syndrome rare d'insuffisance médullaire (BMF) présentant des anomalies des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, une anémie, une thrombocytopénie et un risque accru d'évolution vers une myélodysplasie et une leucémie myéloïde aiguë. Bien que la BMF dans l'AF est pensée être due à l'altération de la réponse aux dommages de l'ADN et de l'instabilité génétique associée, nous avons actuellement une compréhension encore largement imparfaite du lien entre l'inactivation génétique d'une protéine FANC, les altérations de la réparation de l'ADN associées et leurs conséquences en termes de résultats cellulaires et cliniques. Nous avons récemment décrit que les cellules mutées FANCA présentent des anomalies nucléolaires/ribosomiques ayant un impact sur le taux de traduction. Nous proposons que la BMF, l'érythropénie et la thrombocytopénie dans l'AF reposent sur des défauts du transcriptome et du translatome plutôt que sur une stabilité génétique altérée. Notre hypothèse est que les altérations du nucléole, de la biogénèse des ribosomes et de la traduction caractérisées chez les patients déficients en FANCA (70% des patients atteints d'AF), affectent l'homéostasie de la moëlle osseuse, la méga- et érythropoïèse, deux processus affectés par de tels mécanismes moléculaires. Pour étudier notre hypothèse, le projet sera séparé en 6 volets visant à : 1- caractériser l'activité nucléolaire, ribosomale et les mécanismes de traduction dans les cellules hématopoïétiques de souris Fanca+/+ et Fanca-/- in vivo. 2- Caractériser l'activité nucléolaire, l'activité des ribosomes et les mécanismes de traduction pendant l'érythropoïèse dans des cellules primaires ou des lignées cellulaires in vitro de souris Fanca+/+ et Fanca-/-. 3- caractériser l'activité des nucléoles et des ribosomes pendant l'érythropoïèse dans un modèle cellulaire primaire humain FANCA-proficient et déficient. 4- caractériser l'activité nucléolaire et ribosomale dans les mégacaryocytes provenant de cellules primaires murines Fanca+/+ et Fanca-/- ou de cellules CD34+ humaines. 5- caractériser l'activité translationnelle dans les réticulocytes énucléés différenciés en phase terminale et les plaquettes provenant de cellules de souris Fanca+/+ et Fanca-/-. 6- tester des stratégies pour restaurer les déficiences de traduction dans les FA. Ces connaissances, nécessaires pour développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d'améliorer les soins aux patients atteints d'AF, permettront, incidemment, de mieux comprendre l'hématopoïèse normale. Grâce à la disponibilité de molécules capables de moduler les médiateurs associés aux anomalies nucléolaires et ribosomiques, nos observations ouvriront de nouvelles perspectives thérapeutiques pour tester et améliorer la santé des patients atteints d'AF.

Les mutations des gènes de la voie des RHO GTPases sont responsables de déficience intellectuelle (DI), de troubles psychiatriques et d’anomalies de développement du cerveau. La grande hétérogénéité phénotypique associée aux différentes mutations de ces gènes rend difficile le développement de solutions thérapeutiques. Grâce à l’étude d’un gène de cette voie, PAK3, notre objectif est d’établir la corrélation génotype/ phénotype afin de définir les règles de pathogénicité des mutations, de préciser les mécanismes moléculaires sous-jacents et de proposer des approches thérapeutiques. 1- Notre projet est de décrire la corrélation génotype/phénotype pour une vingtaine de mutations du gène PAK3 afin de comprendre pourquoi elles aboutissent à des formes plus ou moins sévères de DI, parfois associées à d’autres défauts neurodéveloppementaux. Pour ce faire, nous établirons la plus grande cohorte jamais réalisée de patients et de patientes porteurs de mutations de ce gène et nous ferons sa description clinique. En parallèle, nous caractériserons les défauts fonctionnels des variants mutés et leur effet sur la biologie cellulaire (forme, adhésion, migration) ainsi que sur la différenciation neuronale (croissance neuritique et formation des épines dendritiques). Notre hypothèse est que la pathogénicité des mutations n'est pas due simplement à une perte ou un gain de fonction mais fait intervenir des mécanismes plus complexes d'interférence de signalisation. En effet, la présence d'une protéine mutée stable est souvent plus délétère que l'absence d'une protéine. 2- Pour aller plus loin dans l’analyse des formes sévères de la maladie, nous avons créé un nouveau modèle knock-in d’une mutation de PAK3 responsable d’une DI sévère et d’une microcéphalie secondaire. La souris modèle présente de fortes anomalies comportementales et cognitives ainsi qu’une microcéphalie secondaire, rappelant le cas clinique. Notre projet consistera à caractériser plus finement les phénotypes comportementaux et cognitifs de cette souris afin de les comparer à ceux du patient. Nos analyses ex-vivo et in-vitro préliminaires nous ont permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire pathogène que nous disséquerons de manière approfondie. 3- Nous développerons deux stratégies de sauvetage phénotypique en vue de solutions thérapeutiques. La première concerne les formes sévères. La dégradation d'une protéine PAK3 pathogène stable devrait restaurer au moins partiellement les anomalies phénotypiques caractéristiques des formes sévères. Cette stratégie de dégradation ciblée des protéines pathogènes stables n'a jamais été explorée dans le cadre des maladies neurodéveloppementales alors qu’elle est en cours de développement en cancérologie. Elle serait aussi applicable aux mutations activatrices des gènes de la voie des RHO GTPases. Enfin, la Cofiline étant le point de convergence de la voie des RHO GTPases, plusieurs stratégies ciblant ce régulateur de la polymérisation de l'actine ont déjà été développées pour corriger les défauts de comportement et de plasticité synaptique. Notre objectif est de démontrer que cette approche permet également de corriger les anomalies de différentiation neuronale au cours du développement post-natal. Ainsi, nous testerons l'efficacité d’un peptide Cofiline pour restaurer l'arborisation neuritique et la formation des épines dendritiques chez la souris mutée. Ce projet repose sur des résultats préliminaires solides et un consortium déjà opérationnel de 2 équipes de cliniciens et de 3 équipes de recherche (l’une ayant la double compétence). Ce projet permettra de comprendre la relation génotype/phénotype pour les mutations du gène PAK3, mais aussi pour celles des autres gènes de la voie des RHO GTPases. Ces résultats permettront d’améliorer le conseil génétique et le suivi des patients. Ce projet post-génomique et préclinique permettra de poser les jalons d’approches thérapeutiques dans l’optique du développement d’une médecine personnalisée

HYPOTHÈSE L'analyse multiplexée de la diversité et des cibles de la sensibilisation fongique induite par l'exposome permet de modéliser les risques et de prédire à long terme, au niveau de la population et de l'individu, la fonction pulmonaire, corrélat de longévité et de qualité de vie. OBJECTIFS Objectif principal: Établir un schéma de biomarqueurs de sensibilisation multiplexe à l'exposome fongique environnemental et à l'inflammation allergique associée aux trajectoires temporelles de la fonction pulmonaire chez les adultes asthmatiques et en bonne santé de la partie française de la cohorte ECRHS (cohorte découverte). Les biomarqueurs sélectionnés décriront la sensibilisation allergique révélée par des anticorps antifongiques d'isotype E (IgE), en utilisant une plateforme d'allergènes multiplex personnalisée comprenant tous les genres de champignons allergéniques actuellement connus, et l'inflammation allergique basée sur des molécules liées à l'activation des éosinophiles. FUNGIPLEX implique et est coordonné par les investigateurs principaux cliniques et scientifiques d'ECRHS France: Pr P. Demoly (coordinateur FUNGIPLEX et IP clinique ECRHS, Montpellier), Dr I. Pin (IP clinique ECRHS, Grenoble), Dr C. Neukirch (IP clinique ECRHS, Paris), Pr C. Raherison (IP clinique ECRHS, Bordeaux), Dr B. Leynaert (coordinateur scientifique de l'ECRHS France, Paris). La conception de l'étude FUNGIPLEX explorant la sensibilisation allergique aux allergènes environnementaux est conforme aux exigences éthiques et réglementaires de l'ECRHS. Objectifs secondaires: 1. Pour tester la cohorte de découverte, deux cohortes de réplication distinctes seront analysées: -Réplication pédiatrique des résultats obtenus chez l'adulte: réplication dans l'asthme pédiatrique. Réalisation: cohorte française SAMP composée de 424 patients préscolaires et scolaires. Pr J. Just (Paris), investigateur principal de SAMP, est impliquée dans FUNGIPLEX en tant que chef d'équipe scientifique. - Réplication dans ECRHS Suède des résultats ECRHS France. ECRHS Suède a été conçu et réalisé de la même manière que ECRHS France. L'ECRHS Uppsala comprend 302 patients évalués aux mêmes 3 temps. Les investigateurs principaux cliniques de l'ECRHS Uppsala: Pr C. Janson et Pr A. Malinovschi participent à FUNGIPLEX en tant que responsables d'équipe scientifique (sur fonds propres). 2. Pour améliorer la détection au niveau individuel de la susceptibilité aux effets pulmonaires et de santé à long terme de l'exposome fongique: FUNGIPLEX reliera les questionnaires d'exposition aux moisissures avec la sensibilisation observée par multiplex allergénique fongique. ORIGINALITÉ Un hub translationnel des données épidémiologiques à la médecine personnalisée dans le contexte de l'exposome fongique. RÉSULTATS ATTENDUS En termes de nouvelles connaissances, FUNGIPLEX fournira la description de l'évolution de la sensibilisation fongique en relation avec les effets cliniques à différents moments de la vie et en tenant compte des différentes régions au niveau de la population générale. Il est à noter que certains des champignons n'ont jamais été étudiés dans le contexte d'études de cohorte. Les déterminants de cette évolution seront étudiés en tenant compte d'une approche EnvWAS. Ces informations seront utilisées à des fins de prévention personnelle. Cliniquement, FUNGIPLEX fournira un test multiplex fongique extensif à utiliser dans d'autres cohortes ainsi qu'en routine clinique. PRODUIT FINAL DÉVELOPPÉ Le test multiplex développé dans l'étude FUNGIPLEX aidera à identifier les allergènes fongiques les plus informatifs et servira de base à des outils multiplex sur mesure. Ces outils sont nécessaires pour l'investigation approfondie ou ciblée d'autres maladies fongiques impliquant des IgE, des IgG ou des IgA dans le sérum ou des échantillons locaux (liquide nasal, crachats), e. g. pneumopathie d'hypersensibilité, mycoses bronchopulmonaires allergiques et rhinosinusite fongique allergique.

La mitochondrie est apparue ces dernières années comme une cible thérapeutique d’intérêt. Cet organite des cellules eucaryotes joue un rôle fondamental dans la production énergétique de la cellule. Les désordres qui peuvent intervenir en son sein ont été reliés à une grande diversité de pathologies telles que des maladies neurodégénératives, métaboliques, cardiovasculaires et maladies rares mitochondriales. Ainsi, depuis la fin des années 80, différentes stratégies de vectorisation ont été développées, permettant le transport de substances actives à l’intérieur de la mitochondrie. Elles sont basées sur une association covalente non clivable entre une drogue et une fonction chimique spécifique appelée vecteur mitochondrial. Le nombre grandissant de molécules agissant sur la fonction mitochondriale actuellement en essais clinique ou sur le marché témoigne de l’importance de cet enjeu. Dans le même temps, l’activité de certaines enzymes Red/Ox a pu être mise en évidence dans les mitochondries par microscopie de fluorescence, grâce à la synthèse de sondes fluorogéniques activables enzymatiquement. Le projet MitoRedAct envisage d’utiliser ces activités enzymatiques pour l’activation de pro-drogues dites « mito-ciblées ». A notre connaissance, aucune stratégie de ce type n’a été décrite pour la libération sélective de molécules d’intérêt thérapeutique à l’intérieur de la mitochondrie. La finalité de ce projet est de concevoir puis d’appliquer des stratégies de fonctionnalisation chimique de petites molécules qui permettront leur transport puis leur libération sélectivement à l’intérieur de la mitochondrie. Pour cela des sondes tripartites (architecture moléculaire composée de trois membres) comprenant un déclencheur activable enzymatiquement, un vecteur mitochondrial, et un fluorogène ou une pro-drogue seront conçues et synthétisées. Des espaceurs "auto-immolables" (EAIs) originaux intégrant un motif mito-ciblant seront développés. Ils permettront de faire coïncider l’activation de divers déclencheurs enzymatiques avec la libération d’un fluorophore ou d’une drogue dans la mitochondrie. Le projet MitoRedAct est un projet de chimie thérapeutique qui est conçu autour de deux « workpackages ». Un premier (WP1) vise à la conception et la synthèse d’EAIs pour la construction de pro-drogues mito-ciblées activables par la nitroréductase de Type 1, dont la présence et l’activité dans les mitochondries ont déjà été démontrées. Ils doivent permettre la vectorisation puis la libération d’une grande variété de molécules d’intérêt thérapeutique à l’intérieur de la mitochondrie. La libération sélective de S-adenosyl methionine (SAM) a été choisie comme modèle pour la validation des systèmes de pro-drogue « mito-ciblée » qui auront été préparées. Elle aura pour but de compenser la déficience du transporteur SLC25A26 (nécessaire à l’entrée de SAM dans la mitochondrie), qui engendre un défaut de méthylation intra-mitochondriale à l’origine d’une insuffisance cardiopulmonaire néonatale sévère. Un second workpackage (WP2) aura pour but de trouver de nouvelles activités enzymatiques intra-mitochondriales, pouvant servir d’alternative à la nitroréductase. Cela permettra de diversifier la gamme des pro-drogues mito-ciblées. Dans ce but, des sondes fluorogéniques mito-ciblées seront conçues, synthétisées et testées in vitro et in cellulo. Ces sondes dont le comportement fluorogénique sera induit par l’activité enzymatique ciblée, seront de type intensiométriques « OFF-ON » et/ou ratiométriques afin de visualiser leur activation in cellulo. Des expériences de microscopie confocale seront menées pour localiser le signal lumineux et confirmer le caractère intra-mitochondrial de l’activation enzymatique. L’approche envisagée est exemplifiée dans ce projet par la détection de l’activité azoreductase et pourra facilement être étendue à d’autres activités enzymatiques en modifiant le déclencheur.

Une étude innovante a montré que l’administration par voie intraveineuse de nanomédicaments à base de Leu-enképhaline (LENK) couplée au squalène, un lipide endogène, présentait un effet antinociceptif prolongé dans un modèle de douleur inflammatoire chez le rat. NANOPAINKILL vise maintenant à répondre aux questions suivantes: Peut-on utiliser la même approche avec des inhibiteurs d’enképhalinases tels que l’opiorphine (OPN)? Peut-on améliorer l’activité antinociceptive avec des nanoparticules de LENK combinées aux OPN? L’administration de ces nanomédicaments par des voies autres que l'intraveineuse permet-elle d'obtenir un effet anti-nociceptif intéressant? Ces nanomédicaments sont-ils efficaces sur d’autres types de douleurs, telles que neuropathiques, post opératoires ou cancéreuses? L’utilisation des nanomédicaments à base de LENK et/ou OPN permet-elle réellement d’éviter des effets secondaires et une sensibilisation centrale comme c’est le cas avec la morphine et ses dérivés?

L'os est un tissu vivant soumis à divers stimuli. Les cellules reçoivent des signaux mécaniques, chimiques ou biophysiques à travers leur environnement. L'information se traduit par une capacité d'adaptation à toute modification environnementale. Dans le contexte de l'ingénierie tissulaire osseuse (ITO), cette propriété peut être exploitée pour produire des substituts ostéogéniques à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM) ensemencées dans des matériaux poreux cultivés dans des conditions dynamiques. Ce matériau poreux est nécessaire pour accueillir les cellules et guider leur croissance et leur régénération tissulaire dans un environnement 3D. Pour surmonter les limitations du transport des nutriments et pour soumettre les cellules à des contraintes mécaniques favorables, des bioréacteurs sont utilisés. La production de substituts ostéogéniques en bioréacteur repose sur une approche rudimentaire par rapport à celle développée en génie des procédés, qui reposent sur la modélisation et intègrent les aspects multi-échelles et multi-physiques. Il apparaît nécessaire de rationaliser la conduite des bioréacteurs. L'originalité de notre approche réside dans le développement de méthodes de contrôle et de quantification des transferts de masse et de mouvements au sein d'un bioréacteur. Des simulations numériques fournissant les champs de contraintes et de concentration en nutriments subis par les cellules prolongeront systématiquement les expériences. A l'interface de la physique, de la mécanique et de la biologie, HydrOs vise à produire des substituts osseux ostéogéniques vascularisés à partir d'une coculture de MSC et de cellules endothéliales (CE) ensemencées dans des hydrogels de polysaccharides supplémentés ou non par des particules d'hydroxyapatite (HAp). Les cellules seront cultivées dans notre bioréacteur à perfusion caractérisé expérimentalement et numériquement. Les connaissances actuelles concernant la fabrication des matériaux ostéogènes, l'influence de sa structuration interne sur la formation de structures biologiques pertinentes, la compréhension de l'influence du transport des espèces et des mécanismes de dynamique ne permettent actuellement pas d'envisager une translation du processus à la clinique. Notre ambition est de compléter ce champ de connaissances. Un paramètre clé est la compréhension et le contrôle de la structuration de la porosité de l’hydrogel pendant sa fabrication. Dans WP1, les propriétés morphologiques, mécaniques et diffusionnelles de l'hydrogel seront caractérisées. Nous étudierons comment l'environnement mécanique et les gradients de nutriments influencent le devenir des MSC. Dans WP2, nous développerons un jumeau numérique du bioréacteur qui fournira le champ de concentration en nutriments et le champ de contraintes au sein du bioréacteur afin de connaître les conditions locales vues par les cellules. Pour cela, nous devons modéliser le comportement mécanique des hydrogels, décrire les interactions entre les hydrogels déformables et l'hydrodynamique au sein du bioréacteur et modéliser le transport des nutriments dans le bioréacteur. Dans WP3, un bioréacteur produira des substituts à partir d'hydrogel de porosité et de propriétés mécaniques contrôlées (développées en WP1) ensemencées avec une co-culture de MSC et d'EC puis cultivées dans des conditions optimisées fournies par le jumeau numérique développé en WP2. Les marqueurs de différenciation seront quantifiés et, grâce à la simulation numérique, corrélés avec l'hydrodynamique, le champ de contraintes et les transferts de masse au sein du bioréacteur. Le potentiel du bioréacteur à améliorer la formation d'un réseau vasculaire dans les sphéroïdes sera évalué (WP3). Dans le WP4, le potentiel des substituts ostéogènes produits dans le bioréacteur et l'évaluation du bénéfice de la supplémentation des hydrogels en HAp pour favoriser l'ostéoinduction seront évalués in vivo.

Un traitement par oligonucléotides antisens (ASO) peut être créé pour tout patient, toute cible, même celles considérées depuis longtemps comme « intraitables » par les thérapies traditionnelles. En 2019, plus de 12 000 patients avaient déjà reçu un traitement ASO pour traiter différentes maladies. Bien que ces molécules soient prescrites, leurs mécanismes d’entrée et d’action restent mal compris. De plus, la majorité des maladies ciblées par les ASO nécessitent des injections récurrentes d’ASO. Ainsi, l'efficacité des ASO doit être améliorée afin de réduire les quantités administrées et leurs toxicités consécutives. Nous prévoyons 1) d’identifier les protéines impliquées dans l’internalisation des ASO et leur guidage vers leurs cibles ARN (crible CRISPRa de tous les gènes codants), 2) de confirmer les partenaires protéiques des ASO (ASO pull-down couplé à la spectroscopie de masse), et 3) d’améliorer l'efficacité des ASO en modulant les interactions ASO-protéines. L'originalité du projet repose sur trois éléments clés. Les protéines régulatrices de l'activité des ASO seront identifiées sans à priori à l'aide d'un crible génétique (CRISPRa) couvrant l'ensemble des gènes codants. Pour maximiser nos chances de succès, deux cribles complémentaires seront réalisés ciblant deux ARN différents (un ARN endogène ; TYRP1 et un ARN exogène ; Thymidine Kinase). Le deuxième point fort de ce projet repose sur l’utilisation d’ASO différents (mode d’action et chimie). Cette étude systématique doit mettre en évidence les spécificités d’interactions (ASO-protéines). Le troisième point fort du projet est lié à la validation in vivo de nos découvertes puisque la priorité du projet est d’améliorer l’efficacité in vivo des ASO. Au-delà de la description de(s) route(s) intracellulaire(s) empruntée(s) par ces ASO, le projet aidera à concevoir des ASOs d’une nouvelle génération évitant l’interaction avec les protéines inhibitrices des ASO et favorisant l’interaction avec les protéines impliquées dans l’effet thérapeutique des ASO. Les retombées pour la communauté et les patients seront rapides car il est désormais concevable de générer des ASO évitant certaines voies de dégradation et ainsi augmenter leur efficacité thérapeutique (ex: nucleolin-specific aptamers). La complémentarité des deux équipes impliquées et leurs expertises dans différents modèles de maladies (cancer et maladies génétiques rares) et dans divers types d'ASO renforcent le potentiel et la faisabilité de ce projet. Étant donné que la thérapie à base d’ASO peut être créée pour n'importe quel patient, n'importe quelle cible, y compris des cibles qui ont longtemps été considérées comme "non médicamenteuses" par les thérapies traditionnelles, ce projet vise à améliorer à la fois l'efficacité et la tolérance de l'ASO, et par conséquent à réduire le coût de cette thérapie. L'avenir de l'ASO sera certainement prodigieux puisque l'ASO est conçu sur mesure pour les maladies d’origine génétique et correspond à la quintessence de la médecine de précision.

La leishmaniose est un grave problème de santé publique et les traitements actuels sont toxiques, coûteux ou conduisent à une résistance parasitaire, il y a donc un besoin urgent de nouveaux médicaments. Le consortium TEXLEISH propose un nouveau paradigme : inhiber les interactions hôte-parasite, en ciblant l’exoprotéome de Leishmania, afin de limiter le risque de résistance parasitaire. TEXLEISH met en synergie une expertise importante en chimie médicinale, kinases, biologie des parasites et en tests in vivo pour optimiser CTN1122, un composé chef de file puissant antileishmanien, en un candidat médicament actif par voie orale, sûr et efficace. Ce processus implique des cycles itératifs de synthèse chimique, d’évaluation de son efficacité, sa toxicité, sa biodisponibilité in vitro, son efficacité in vivo sur modèles animaux et l’étude de son mode d’action. Le projet TEXLEISH constituera une preuve de concept pour valider l’exoprotéome pathogène comme l’avenir des stratégies ciblées.

Les éléments d'origine rétrovirale, ou HERVs (human endogenous retroviruses), représentent une proportion importante du génome humain. Globalement réprimés en raison de leur origine infectieuse, ils peuvent s’exprimer dans des contextes normaux, notamment la placentation, et/ou pathologiques. Dans les cancers, l'hétérogénéité épigénétique peut entraîner l'activation d'un ensemble de HERVs, qui peuvent à leur tour être associés à l'expression aberrante d'oncogènes via l'utilisation de leurs régions promotrices (LTR, long terminal repeats). Bien qu’issues d'infections intégratives survenues il y a des dizaines de millions d'années, certains gènes de HERV codent encore pour des protéines d'enveloppe fonctionnelles, dont la capacité à se lier à un récepteur endogène -voire de réaliser une fusion cellulaire- a été maintenue. Au cours de nos travaux portant sur les protéines d’enveloppe des HERVs, nous avons identifié plusieurs récepteurs et obtenus des anticorps spécifiques. Ces ligands sont utilisés pour développer de nouveaux outils thérapeutiques qui ciblent les protéines d’enveloppe de HERVs tumeur-spécifiques, HERV-K et HEMO. Des pseudotypes ont été « re-ciblés » grâce à l’expression de 2 protéines de la rougeole, la protéine F sauvage et la protéine H fusionnée à des ligands de HERVs. En partenariat avec VIROxIS, nous proposons de produire des lots précliniques de virus oncolytiques de type virus de la rougeole ou virus de la stomatite vésiculaire (VSV) re-ciblés contre les HERV-K et HEMO et d'évaluer leur activité contre des tumeurs humaines issues de cancers digestifs, gynécologiques et pulmonaires greffables chez la souris (PDX, patient derived xenograft). Le re-ciblage des virus oncolytiques a pour objectif de réduire les risques d'infection/élimination des cellules non cancéreuses. En outre, l’efficacité des virus oncolytiques re-ciblés pourra être accrue grâce à des approches bispécifiques, combinant un récepteur et un anticorps liant l'enveloppe de l’HERV ciblé. Au cours de nos études, nous avons obtenu l’infection de près de 50 % des cellules positives pour l’enveloppe de HERV-K grâce à des pseudotypes exprimant la protéine H fusionnée au récepteur de HERV-K et des pourcentages moindres pour des pseudotypes H fusionnée avec les scfv anti-HERV-K ou anti-HEMO. C’est pourquoi, ce programme de recherche débutera par la préparation de lots pré-cliniques de virus oncolytiques H fusionnée au récepteur de HERV-K, tandis que de nouveaux anticorps anti-HERV-K et anti-HEMO seront sélectionnés à partir de banques d’anticorps humanisés. Nous disposons actuellement de plus de dix anticorps contre les deux protéines d'enveloppe ciblée dans ce programme et un nouveau criblage de banques d'anticorps a d’ores et déjà débuté en collaboration avec l'institut Curie. La validation des anticorps anti-HERVs sera réalisée à la suite de leur évaluation dans des souris PDX sous le format anticorps drogue-conjugué (ADC). Les anticorps présentant la meilleure activité anti-tumorale seront fusionnés à la protéine H pour être appliqués aux virus oncolytiques. En parallèle, leur activité anti-tumorale sera également évaluée sous la forme de lymphocytes T « chimeric antigen receptor » (CAR). Ce programme de recherche vise la mise au point de nouvelles thérapies contre le cancer basées sur l’utilisation des récepteurs de HERVs et d’anticorps spécifiques, en particulier des virus oncolytiques re-ciblés mono ou bispécifiques jamais développés jusqu’à présent, qui en raison de leur caractère réplicatif pourraient éliminer efficacement les tumeurs solides.

La sécrétion biliaire est une fonction essentielle du foie, nécessaire à la digestion des graisses alimentaires et l’élimination de xénobiotiques et de métabolites endogènes. Cette fonction dépend principalement de l‘activité de transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) localisés au niveau de la membrane canaliculaire des hépatocytes. Ces transporteurs permettent la sécrétion biliaire de composés hydrophobes tels que les phospholipides pour ABCB4 et les sels biliaires pour ABCB11. Des variations génétiques de ces transporteurs sont associées à des maladies cholestatiques rares, les formes les plus sévères de ces maladies étant les cholestases intrahépatiques familiales progressives (PFIC) de type 2 (défauts d’ABCB11) et 3 (défauts d’ABCB4) qui touchent notamment les enfants durant les premiers mois de vie. L’acide ursodésoxycholique permet d’améliorer la condition de la plupart des patients atteints de formes légères de maladies liées à des déficits d’ABCB4 ou d’ABCB11. Cependant, ce n’est pas le cas pour la plupart des formes sévères et la transplantation hépatique reste la seule alternative pour la majorité des patients atteints de PFIC2/3. Afin d’éviter (ou de retarder) la transplantation, notre projet vise à identifier des petites molécules d’intérêt thérapeutique corrigeant les défauts moléculaires d’ABCB4 et ABCB11 dus à des mutations de gènes encodant ces transporteurs. Pour ce projet, des analogues structuraux (non-inhibiteurs de kinase) de la roscovitine, une purine trisubstituée, seront utilisés afin de restaurer le trafic intracellulaire et la fonction de variants d’ABCB4 et d’ABCB11 identifiés chez les patients atteints de maladies cholestatiques rares. Les molécules candidates seront sélectionnées en suivant le programme de recherche suivant : 1) Les analogues de roscovitine non-inhibiteurs de kinase seront synthétisés en faisant varier le noyau et les substituants chimiques de la molécule mère, créant ainsi une chimiothèque virtuelle de plus de 70,000 composés. 2) La capacité des molécules nouvellement synthétisées à restaurer le trafic et la fonction des variants génétiques déficients d’ABCB4 et d’ABCB11 sera analysée dans des modèles cellulaires adaptés. Les molécules présentant les meilleurs rapports bénéfice/toxicité seront ensuite validées dans des modèles murins. 3) Les meilleures molécules seront optimisées chimiquement afin d’augmenter le rapport bénéfice/toxicité, en abaissant notamment au maximum les concentrations efficaces. Ce processus sera assisté par la modélisation moléculaire. Des simulations de dynamique moléculaire permettront d’étudier l’impact structural des mutations génétiques mais également l’interaction potentielle des candidats médicaments avec les transporteurs ABC sauvages ou mutés. 4) Les molécules candidates sélectionnées seront validées chez la souris afin de : i) déterminer leur ADMET (Absorption, Distribution, Métabolisme, Elimination et Toxicité) ; ii) valider leur efficacité à restaurer la sécrétion biliaire dans des modèles murins mimant les pathologies humaines (expression des transporteurs humains mutés par injection d’AAV8 chez des souris KO). Ce projet réunit l’expertise de trois partenaires (deux académiques et une entreprise de biotechnologie) dans les domaines de la médecine, la pharmacologie, la biologie, la chimie médicinale, la biochimie et la modélisation moléculaire. Notre objectif principal est de fournir une preuve de concept que des analogues de roscovitine peuvent être considérés comme une alternative pharmacologique à la transplantation hépatique pour des patients atteints de maladies cholestatiques rares liées à des défauts d’ABCB4 ou d’ABCB11. Une approche préclinique est un prérequis au développement industriel et à la mise sur le marché de nouveaux candidats médicaments. De plus, notre approche pourrait être élargie à des pathologies causées par d’autres altérations du trafic intracellulaire, en lien avec des mutations génétiques chez les patients.

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) sont des troubles inflammatoires chroniques de l'intestin qui ont un impact socio-économique et sanitaire considérable dans le monde entier. Malheureusement, il n'existe aucun traitement curatif des MICI et les thérapies actuelles ne font qu'atténuer la réponse inflammatoire. Une approche prometteuse pour prévenir et traiter les MICI comprend l'administration orale de bactéries probiotiques et commensales. Par exemple, il a été démontré que la bactérie commensale Faecalibacterium prausnitzii (l'une des espèces de bactéries intestinales les plus abondantes chez les individus sains) joue un rôle clé dans les maladies intestinales et sert de biomarqueur de santé générale chez l'homme. En effet, cette bactérie réduit efficacement l'inflammation intestinale et améliore la fonction de la barrière intestinale grâce à des métabolites sécrétés capables de bloquer l'activation du NF-kb et la production d'IL-8. En outre, F. prausnitzii produit de grandes quantités de butyrate, un acide gras à chaîne courte (AGCC), qui est important dans l'homéostasie intestinale et contribue aux effets anti-inflammatoires de F. prausnitzii. Pour identifier le récepteur de l'hôte et les voies de signalisation impliquées, nous avons effectué une analyse transcriptomique en utilisant des cellules épithéliales intestinales humaines (IEC : i.e. cellules HT-29) et le surnageant (SN) de F. prausnitzii. Nous avons constaté que le SN de F. prausnitzii régulait à la hausse l'expression de Dact3, un gène lié à la voie Wnt/JNK, qui fait partie du processus inflammatoire. La régulation positive de Dact3 est associée à une réduction de l'expression d’IL-8. De façon intéressante nous avons constaté que l'inhibition de l'expression de Dact3 entraîne une perte des effets anti-inflammatoires du SN de F. prausnitzii, ce qui suggère un rôle important dans la modulation de Dact3. Le butyrate a été identifié comme un effecteur de F. prausnitzii responsable de la modulation de Dact3 et de l'inhibition d’IL-8. Ces résultats apportent de nouveaux indices sur les mécanismes moléculaires de l'hôte impliqués dans les effets anti-inflammatoires de F. prausnitzii. Malgré des progrès importants, la plupart des mécanismes moléculaires de l'hôte qui sous-tendent les effets anti-inflammatoires de F. prausnitzii restent à découvrir. L'objectif de ce projet est de déterminer le rôle de Dact3 dans l'homéostasie intestinale (en particulier dans les conditions inflammatoires) et surtout, d'élucider l'impact de F. prausnitzii et du microbiote intestinal sur l'expression de Dact3. Notre hypothèse est que Dact3 pourrait être un régulateur principal de l'homéostasie intestinale. Nous espérons fournir des données solides sur les mécanismes impliqués dans les effets bénéfiques de F. prausnitzii avec la perspective de confirmer le rôle clé de Dact3 dans l'homéostasie intestinale et de proposer une nouvelle alternative biomédicale innovante pour la prévention et le traitement des MICI en utilisant cette bactérie commensale ou Dact3 comme médicament pharmacologique.

L’objectif du projet MOBIDIC est de développer une approche innovante de traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) par de nouveaux bio-médicaments oraux. A ce jour, ces maladies restent incurables. L’un des premiers éléments déclencheurs de l’inflammation étant une surproduction d’espèces réactives de l’oxygène, nous proposons de cibler cette étape pour contrôler l'inflammation intestinale au cours des MICI. Pour ce faire, nous concevons des antioxydants métalliques à manganèse (Mn) reproduisant l’activité d’une enzyme de protection contre le stress oxydant : la superoxyde dismutase (SOD). Ces mimes de SOD (SODm) coordonnés au Mn, offrent des possibilités thérapeutiques, et parce qu’ils agissent de façon catalytique, permettent d’envisager une efficacité à faible dose. Il s’agit de petites molécules diffusibles qu’elles soient de nature synthétique (SODm-A) ou peptidique (SODm-P). Ces molécules seront criblées sur des modèles cellulaires, macrophages et cellules de l’épithélium intestinal, représentant les cellules de première ligne de la muqueuse intestinale, capables d’engager une réponse inflammatoire en réponse au stress oxydant. Ce criblage permettra de déterminer les SODm les plus efficaces, c’est-à-dire ayant la meilleure activité anti-inflammatoire après induction d’un stress oxydant. Ces SODm les plus efficaces seront ensuite testés sur modèles murins de colite en les administrant par voie orale dans le but de prévenir la colite. Dans le cadre de cette administration par voie orale, et afin d’éviter la dégradation liée à l’environnement gastrique acide puis biliaire, nous explorerons une délivrance originale utilisant plusieurs bio-technologies. Elles feront l’objet d’un dépôt de brevet et ne peuvent pas être abordées dans un résumé ‘non confidentiel’. Après leur délivrance dans le tube digestif, nous analyserons la capacité de ces SODm (A et P) à se coordonner au Mn(II) in vivo par des approches de spectrométrie de masse. Nous pourrons finement réguler cette coordination en choisissant une voie bio-technologique et/ou un environnement (lumière intestinale) naturellement riches en Mn(II) ou en supplémentant nos systèmes en Mn(II). Nous évaluerons l’effet sur la barrière intestinale (tests de la perméabilité) et sur la réponse inflammatoire (score de colite macro et microscopique, dosage de cytokines et de chimiokines dans les muqueuses et systémiques) de ces SODm ainsi vectorisés dans la lumière intestinale. Enfin, chez des patients atteints de MICI, à l’aide de questionnaires dédiés et au cours d’une étude prospective, nous apprécierons l’acceptabilité de ces nouveaux types de bio-médicaments.

L'émergence de virus respiratoires pandémiques (e.g. le coronavirus SARS-CoV-2, certains virus de la grippe A (IAV),..) est une préoccupation majeure. Il n'existe à présent aucun médicament efficace anti-SARS-CoV-2 et l'efficacité des antiviraux anti-IAV est contestée. La vaccination constitue en théorie la meilleure stratégie préventive. Cependant, la dérive antigénique des IAV peut réduire l’efficacité vaccinale. Par ailleurs, les anticorps faiblement neutralisants développés après certaines vaccinations anti-coronavirus peuvent occasionner des risques. Enfin, la réticence de certains à la vaccination anti-SARS-CoV-2 est un obstacle supplémentaire. Notre projet ANR vise donc à développer une thérapie métabolique intrapulmonaire innovante contre ces deux virus, basée sur (i) le fait que les métabolites sont désormais reconnus comme des effecteurs clés de la réponse antimicrobienne et (ii) notre identification de deux métabolites dotés d’activité antivirale anti-IAV et anti-SARS-CoV2.

Nous avons besoin d’approches nouvelles pour combattre les infections du cerveau. En réponse à une infection virale, la production d’interférons de type I (IFN) induit des centaines d’ISG (gènes stimulés par l’IFN). Bien que puissamment antiviraux, les IFN sont peu utilisés en clinique à cause de leurs effets indésirables, surtout dans le cerveau. Nous postulons que l’expression ciblée d’un sous-groupe d’ISG pourrait protéger le cerveau avec peu d’effets secondaires. Nous testerons cette stratégie dans des modèles animaux. Un crible in vivo par surexpression ciblée de ~60ISG sera conduit chez le poisson-zèbre. Ce vaste crible sera rendu possible par une nouvelle méthode basée sur les CRISPR, avec de nombreuses applications. Après expression dans les neurones ou la glie, l’innocuité et la protection virale seront mesurés. Puis, les meilleurs candidats seront testés in vitro et in vivo chez la souris via un transfert de gènes par AAV ciblant les cellules du cerveau, et leur effet antiviral sera testé dans des modèles d'infection par des virus neuroinvasifs à ARN+, ARN- ou ADN

Un grand nombre de maladies neurologiques et neurodégénératives induisent une réponse inflammatoire au sein du système nerveux central, pour limiter leur extension et promouvoir la réparation. Cependant, certains mécanismes physiopathologiques peuvent conduire à une inflammation chronique qui concourt à l’aggravation de l’affection. Les cellules microgliales sont les cellules immunitaires résidentes du cerveau. En conditions inflammatoires, la réponse de ces cellules peut être curative ou destructrice en fonction de leur état d’activation et, du fait de leur forte réactivité, les cellules microgliales activées sont devenues un biomarqueur de neuroinflammation en imagerie. Le récepteur purinergique P2Y12, récepteur couplé aux protéines G (ADP-dépendantes), est reconnu comme un marqueur non seulement homéostatique mais aussi de l’état anti-inflammatoire des cellules microgliales. Il apparait comme une cible de choix pour suivre in vivo l’état de la microglie par imagerie en tomographie par émission de positons (TEP). Cependant, les premiers radiotraceurs qui ont été développés ne passent pas la barrière hémato encéphalique (BHE), bien qu’ils présentent une très forte affinité pour le récepteur. PURImaging propose de relever le défi du développement et de la validation de nouveaux radioligands ciblant le récepteur P2Y12 et capables de passer la BHE pour l’imagerie diagnostique en TEP. Pour atteindre ces objectifs, PURImaging déclinera le programme de travail suivant : 1. développement de nouveaux ligands capables de traverser la BHE et ciblant spécifiquement les récepteurs P2Y12 avec haute affinité et sélectivité, 2. caractérisation des ligands ciblant le récepteur P2Y12 pour leur stabilité métabolique, la biodisponibilité du système nerveux central et leur liaison spécifique, 3. radiomarquage des candidats les plus prometteurs au fluor-18 ou carbone-11 et leur validation in vivo, et 4. utilisation des radioligands pour évaluer l’expression du récepteur dans des modèles animaux de maladies neurodégénératives et sur de tissus humains post mortem. PURImaging doit permettre d’identifier, radiomarquer et caractériser in vivo au moins un candidat radioligand pour les récepteurs P2Y12 avec des propriétés optimisées. Pour concrétiser ces objectifs ambitieux, un partenariat franco-allemand a été établi entre l’unité de recherche BioMaps du Service Hospitalier Frédéric Joliot (CEA) et le Pharmazeutiches Institut de l’université de Bonn. Le transfert clinique à plus long terme d’un tel radioligand pour l’imagerie TEP permettra de mieux comprendre les fonctions microgliales, notamment dans les processus neuroinflammatoires associés aux maladies neurologiques et neurodégénératives. Au-delà de l’imagerie physiopathologique, un tel radioligand pourra servir de compagnon-diagnostic pour le développement de médicaments ou le suivi thérapeutique de patients.

Le corps humain est quotidiennement exposé aux vibrations. Pour les utilisateurs de fauteuil roulant manuel (FRM), ces vibrations sont inhérentes à la locomotion et, d’après la littérature, peuvent avoir des effets néfastes sur les structures anatomiques. Différents paramètres sont susceptibles d'affecter l'exposition aux vibrations : les irrégularités du sol, les caractéristiques anthropométriques de l'utilisateur, et les caractéristiques des FRM tels que les microfissures ou la fatigue mécanique. Or, une loi sur l'économie circulaire datant de 2020 préconise l'utilisation de FRM reconditionnés, donc potentiellement défectueux. Ce contexte souligne ainsi la nécessité de comprendre le comportement vibratoire du couple Utilisateur/FRM. Dans ce cadre, les objectifs du projet HandiVib sont de quantifier l'exposition aux vibrations du couple Utilisateur/FRM afin de comprendre le risque de blessure encouru et de proposer ensuite de nouvelles procédures d’évaluation des FRM. Pour atteindre ces objectifs, HandiVib repose sur trois hypothèses. L'exposition aux vibrations des utilisateurs de FRM (H1) entraîne une augmentation des contraintes musculo-squelettiques et donc du risque de blessure ; (H2) a des conséquences dépendantes du niveau d'atteinte de l'utilisateur ; (H3) augmente avec l'utilisation d'un FRM dont les conditions mécaniques sont dégradées. Ainsi, l'objectif de ce projet est d'étudier l'exposition aux vibrations pour un grand nombre de couples Utilisateur/FRM et de situations. Un protocole expérimental sera développé, associant un ergomètre et des pots vibrants capables de simuler une excitation réaliste. Ce dispositif, combiné à des modèles biomécaniques, sera utile pour déterminer la transmission des vibrations et les forces intervertébrales affectant l'utilisateur en fonction de son niveau de handicap et de l’état mécanique du FRM. L'originalité du projet réside dans l'évaluation simultanée de la transmission des vibrations à travers le corps et des contraintes musculo-squelettiques. HandiVib se déroulera en trois lots de travail techniques : l'un visera à concevoir le dispositif expérimental et deux autres aborderont les hypothèses du projet sur la base de l'expérimentation et de la modélisation biomécanique. HandiVib sera dirigé par D. Chadefaux, maître de conférences à l'Université Sorbonne Paris Nord depuis 2018. D. Chadefaux mène ses activités de recherche sur l'optimisation des interactions homme-équipement dans des contextes de chocs et vibrations à l'Institut de Biomécanique Humaine Georges Charpak (Arts et Métiers - Sciences et Technologie). L'équipe sera composée de chercheurs de l'IBHGC, de l'INI-CERAH, mais aussi de l'Hôpital Raymond Poincaré (Garches), et de Politecnico di Milano. Étant donné son potentiel pour améliorer les soins apportés aux utilisateurs de FRM et le développement de procédures innovantes pour l'évaluation des FRM, Handivib répond aux intentions du thème de recherche 8.7 "Technologies pour la santé". Les résultats expérimentaux fourniront un outil au clinicien pour évaluer le risque de blessure encouru pour un FRM donné. Les résultats contribueront également à l'innovation des procédures d'intérêt pour déterminer si un FRM est conforme aux normes de sécurité. Grâce à un modèle analytique simple, un modèle physique pourrait être développé pour améliorer la conception de mannequins de test. Les résultats contribueront également à la détection des défauts mécaniques d'un FRM : une plate-forme d'essai sera mise au point pour évaluer l'aptitude d'un FRM remis à neuf pour une utilisation ultérieure. La base de données expérimentale collectée permettra de comprendre la spécificité de chaque pathologie par rapport à l'exposition aux vibrations. HandiVib contribuera à guider les utilisateurs de FRM dans le choix et le réglage de leur appareil, conformément aux recommandations des thérapeutes en rééducation, afin de minimiser le risque de blessure induit par l'exposition aux vibrations.

La médecine régénérative arrive à maturité et les études précliniques mènent actuellement dans le monde entier, y compris en France, à des essais cliniques dans une diversité d’applications de thérapies cellulaires/tissulaires substitutives. Néanmoins, un obstacle majeur entrave les progrès vers l’expansion de cette nouvelle forme de médecine à tous les patients qui en ont besoin : le rejet immunitaire des greffes de cellules allogéniques. L’utilisation massive de médicaments immunosuppresseurs est clairement interdite, en ce moment, en raison de son risque tumorigène élevé. L’ambition globale du programme Ghosting the Cells (GTC) est de combler cette lacune en concevant une façon originale de procéder à la transplantation de cellules rendues invisibles au système immunitaire du receveur. Nous proposons de le faire par le biais de cellules génétiquement modifiées pour exprimert le peptide immunosuppresseur (ISD) qui permet aux rétrovirus d’échapperà la surveillance immunitaire. Le programme est fondésur deux lignées iPS conçues déjà produites et contrôlées pour leur capacité à se différencier en trois phénotypes cellulaires d’intérêt, à savoir les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Ces cellules, associées à un biomatériau de fibrine dans lequel les deux dernières populations cellulaires sont incrustées, et la première ensemencée à la surface, forment ensemble un substitut dermo-épidermique. Sur la voie de cet objectif global, nous avons identifié quatre étapes intermédiaires. 1. L'identification de biomarqueurs d'efficacité des ISD dans les cellules immunitaires, nécessaire pour suivre les réponses à la greffe de nos cellules. 2. La caractérisation de l'effet protecteur de l'ISD en fonction du statut immunitaire des cellules transplantées, car les cellules endothéliales expriment HLA I et II, tandis que les kératinocytes et les fibroblastes expriment uniquement HLA I, et ce dernier est connu pour susciter une certaine forme de tolérance. 3. L'identification d'un moyen efficace d'éliminer un produit immuno-invisible comprenant des cellules aux capacités prolifératives différentes (kératinocytes>fibroblastes>cellules endothéliales). Un tel "interrupteur de sécurité" est un complément obligatoire au cas où l'on serait confronté à un effet indésirable des cellules transplantées invisibles aux défenses immunitaires normales. 4. Et, enfin, la démonstration finale de l'efficacité et de la sécurité du substitut dermo-épidermique constitué en tissu compact et organisé autour d'un biomatériau. Notre consortium apportera collectivement son expertise dans tous les domaines couverts: 1. Analyses moléculaires et cellulaires des populations de lymphocytes T et NK en présence des cellules exprimant ISD (CNRS 9196, Viroxis); 2. Tests immunologiques in vitro et in vivo d'allo-identification et de tolérance (Viroxis, CRTI INSERM 1064); 3. Production de populations cellulaires homogènes (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales) à partir de lignées iPS humaines (CECS / I-Stem); 4. Production de greffons dermo-épidermiques composites à partir de ces cellules différenciées (CECS/I-Stem); 5. Souris immunodéficientes et secondairement humanisées par PBMC (CRTI INSERM 1064); 6. Modèle de greffe de tissu dermo-épidermique humain chez la souris (CRTI INSERM 1064, CECS/I-Stem). Le succès du programme GTC lèvera un verrou important dans le domaine de la médecine régénérative tout en conduisant, dans le même temps, à des brevets solides et à des publications de rupture. L'intérêt des entités commerciales et / ou des fonds de capital-risque attirés par l'application et l'exploitation de la médecine régénérative issue de l'iPS est anticipé et sera exploité par le biais d'accords de licence. En fin de compte, des stratégies efficaces qui s'attaquent aux barrières immunologiques mèneront à de nouvelles formes de thérapie et devraient réduire les temps d'attente et les coûts encourus par les services de santé.

Le projet DILI-on-chip concerne le développement d’un dispositif microfluidique mimant le lobule hépatique, unité fonctionnelle du foie, pour étudier in vitro la toxicité hépatique (DILI, drug induced liver injury). Des cellules souches pluripotentes humaines issues d’un même donneur seront différenciées pour obtenir les différents types cellulaires (hépatocytes et cellules non-parenchymateuses). Les travées hépatocytaires, bordées par les cellules endothéliales sinusoïdales, et les cholangiocytes formant les canaux biliaires, seront organisées en 3D sur la puce, afin d’obtenir une unité fonctionnelle modélisant le canal de Hering. Les cellules de Kupffer, qui sont très impliquées dans la réponse inflammatoire, seront introduites dans les canaux de vascularisation. Les travées hépatocytaires seront parallélisées et vascularisées dans le circuit microfluidique, afin de favoriser la polarisation des hépatocytes et induire ainsi la formation de canalicules biliaires. La maturation des cholangiocytes permettra la formation de canaux biliaires et leur connexion au réseau de canalicules. La formation sur puce de voies biliaires, extrêmement innovante, conditionne la viabilité des hépatocytes et ainsi d’étudier au mieux la réponse à l’introduction éventuellement répétée de drogues. Le dispositif microfluidique sera constitué de deux parties : i) un support comprenant les connexions fluidiques pour les flux biliaires et vasculaires. Ce support sera moulé en Polydimethylsiloxane (PDMS) par des techniques de lithographie UV, ou répliquées en PolyMethylMetAcrylate par hot-embossing, et ii) plusieurs sous-unités pour la culture cellulaire assemblées sur ce support. Ces sous-unités seront en gel de polysaccharides ; ce matériau biocompatible présente une rigidité proche du tissus hépatique, ainsi qu’une porosité idéale pour les échanges de nutriments et d’oxygène. La géométrie du circuit microfluidique moulé dans ce gel sera optimisée pour induire l’organisation tubulaire des cholangiocytes et des cellules endothéliales. Un avantage clef de ce gel est sa biodégradabilité, qui permettra de récupérer les cellules de la puce pour une analyse transcriptomique (analyse « single cell ») après l’expérience de maturation et d’exposition au médicament testé. Ces sous-unités en gel de polysaccharide seront disposées en réseau sur le support microfluidique en PDMS, afin de démontrer le possible criblage toxicologique dans le contexte DILI. Les effets toxiques des composés hépatotoxiques, en particulier la réaction inflammatoire par l’analyse de sécrétion de cytokines seront analysés sur l’organe sur puce. L’analyse transcriptomique par single cell permettra d’étudier le profil métabolique des différents types cellulaires présents sur la puce. Le projet est organisé en cinq tâches, incluant la tâche de coordination. La tâche 1 sera dédiée à l’obtention des différents types cellulaires requis pour constituer l’organe sur puce. Ces derniers seront différenciés à partir de cellules souches pluripotentes induites provenant du même donneur. Le partenaire 2 a une grande expérience en termes de différenciation de cellules souches. La seconde tâche portera sur la fabrication du dispositif microfluidique, combinant les expertises des partenaires 1 et 4 en microfluidique, à celle du partenaire 3 en termes de préparation de gels biodégradables. La tâche 3 sera dédiée au chargement cellulaire de la puce et à l’optimisation des conditions de culture. L’instrumentation fluidique de l’expérience sera mise en place, permettant l’injection des nutriments et l’extraction de la bile. La polarisation des hépatocytes et la formation de la transition hépato-cholangiocytaire sera caractérisée en temps réel sur la puce. Enfin la tâche 4, menée par le partenaire industriel, permettra d’interroger la réponse de l’organe sur puce à différents types de médicaments connus pour leur toxicité hépatique.

L'avènement de la technologie des cellules souches pluripotentes induites humaine a révolutionné le domaine du développement des thérapies pour les cardiomyopathies dilatées. Les cardiomyocytes dérivés des hiPSC (hiPSC-CM) sont désormais à la base d'un nombre croissant de plates-formes dédiées au criblage à haut débit et à haut contenu (HTS/HCS). Le développement de ces plates-formes soulève des attentes dans le milieu universitaire et dans l'industrie, bien qu'il reste encore des défis à surmonter, tels que l'immaturité des hiPSC-CM par rapport aux myocytes cardiaques adultes. Pour améliorer cela, plusieurs méthodes existent mais ne sont pas compatibles avec les méthodes HTS. Nous faisons l'hypothèse que la culture des hiPSC-CM sur des motifs d’une rigidité et d’une chimie de surface contrôlée améliorera les caractéristiques de ces cellules tout en restant compatible avec les méthodes HTS. Notre premier objectif est de différencier des hiPSC-CM à partir de différentes sources (patients sain ou atteints de cardiomyopathie dilatée). Dans une perspective de criblage de médicaments, les caractéristiques du matériel biologique utilisé doivent être hautement reproductibles pour extraire des informations solides du HTS/HCS. Actuellement, l’obtention des hiPSC-CM n'est pas totalement contrôlée et conduit à de fortes variations de lot à lot. En plus des différences dans l'efficacité de la différenciation, il y a des différences dans les sous-types de cardiomyocytes d'une différenciation à une autre ainsi que de l'état de maturation des hiPSC-CM. Par conséquent, nous combinerons la différenciation monocouche, l'amplification et la spécification ventriculaire des cardiomyocytes pour mettre en place un protocole robuste d’obtention des hiPSC-CM. Des méthodes spécifiques seront utilisées pour mesurer l'homogénéité des hiPSC-CM. Notre deuxième objectif est dédié à la conception et à la fabrication d'une nouvelle plateforme de culture cellulaire biomimétique en tant que produit commercial. Pour mimer le micro-environnement cardiaque, nous proposons de développer des substrats de rigidités qui imitent la rigidité du cœur. Cell&Soft, une entreprise française, a développé une méthode pionnière qui permet l'élaboration de substrats d'hydrogel polymérisés de rigidité physiologiques. Cette technologie répond aux exigences d'une plate-forme HTS/HCS en termes de manipulation et d'imagerie car les substrats à motif en polyacrylamide sont optiquement clairs et peuvent être visualisées avec la plupart des microscopes. Notre troisième objectif est de développer des outils logiciels pour analyser quantitativement la morphologie et la fonction des hiPSC-CM cultivés sur la plateforme biomimétique. Ces outils seront basés sur des approches d'apprentissage en profondeur et après l'acquisition d'images, nous adapterons d'abord un extracteur de fonctionnalités déjà existant pour l'analyse des hiPSC-CM. Dans un deuxième temps, nous créerons un modèle discriminant pour mieux comprendre les caractéristiques des lignées cellulaires mutées par rapport aux témoins. Enfin, pour notre dernier objectif, nous proposons d'abord d'utiliser la microscopie à force atomique pour caractériser mécaniquement des cellules cardiaques, et dans un second temps, de générer de données massives à exploiter par les techniques d'apprentissage en profondeur qui peuvent aider à distinguer les cellules saines et mutantes. Cela nous permettra de corréler la morphologie, la fonction et les propriétés mécaniques des hiPSC-CM pour valider le modèle cellulaire développé et pour obtenir des informations sur les mécanismes physiopathologiques de la cardiomyopathie dilatée. L'objectif final de ce projet est le développement de produits commerciaux, à savoir des plaques de 96 et 384 puits avec des substrats de culture cellulaire à micro-motifs pour la culture de hiPSC-CM compatibles avec les applications HTS/HCS et des outils logiciels pour l'analyse des hiPSC-CM pour les applications HTS/HCS.

La technologie « Opaque » innovante (OTech) dérivée de l’approche de détection « LiquidO » ouvre une synergie sans précédent entre les principaux experts en imagerie médicale et en neutrinos proposant ici un nouveau paradigme basé sur la détection ß+ de haute précision. Nous proposons de construire le premier tomographe à émission de positons basé sur un liquide opaque (LPET) afin de démontrer et de quantifier sa capacité à caractériser pleinement l'annihilation des sources ß+ et ?-ß+ en exploitant les dernières techniques d'apprentissage automatique. La prise en compte du ?-prompt améliorera significativement la reconstruction du point d'annihilation tout en permettant l’analyse directe des tissus par l'étude précise du taux de formation et de durée de vie du positronium donnant par exemple accès au développement de troubles métaboliques. LPET explorera ainsi les limites de l’imagerie TEP d’aujourd’hui tout en ouvrant de nouvelles perspectives sur l’exploration des tissus humains.

Les besoins en radionucléides médicaux sont importants pour augmenter les possibilités d’imagerie/traitement et mieux les adapter aux différents patients. Un critère important pour leur développement est la possibilité de les produire en quantité suffisante avec une grande pureté chimique et isotopique. TTRIP tirera profit de l’utilisation d’un séparateur isotopique de grande performance pour produire un isotope stable de grande pureté (Gd-155) comme précurseur du Tb-155, potentiellement utilisé pour l’imagerie SPECT, en tant qu’isotope du quadruplet théranostique du Tb. La caractérisation de ce précurseur et son irradiation pour produire le Tb-155 complètera cette expérience. Une étude paramétrique sera menée pour trouver les paramètres optimaux de l’ensemble du processus de production. En parallèle, un chélateur bifonctionnel sera optimisé et conjugué à des anticorps monoclonaux ou des fragments d'anticorps ("nanobody") afin de pouvoir les radiomarquer au 155Tb dans des conditions non dénaturantes du vecteur biologique.

Le cancer est une des causes principales de décès. Son traitement repose sur trois piliers (la chirurgie, la radio et la chimiothérapie) ainsi que diverses approches très prometteuses comme l’immunothérapie. Durant la dernière décennie, les thérapies locales reposant sur l’ablation thermique ou la cryo-ablation ont gagné en intérêt car elles sont mini-invasives et non-ionisantes. Parmi ces méthodes d’ablation thermique, les ultrasons focalisés haute intensité (HIFU) ont une place de choix car ils sont totalement non-invasifs, très flexibles (en termes de taille et de position de tumeur), et combinés avec l’imagerie RMN (Résonance Magnétique Nucléaire), sont très précis et fiables car l’IRM fournit des images anatomiques détaillées et permet une cartographie thermique volumétrique en temps réel durant le traitement. L’HIFU repose sur des ultrasons de haute intensité générés à partir d’une source extracorporelle (le transducteur) et focalisés sur les tissus pathologiques afin d’augmenter leur température au-dessus du seuil létal. Cependant, plusieurs défis technologiques sont à résoudre pour intégrer effectivement l’HIFU dans l’environnement contraint de l’IRM. Les principales contraintes sont l’espace très réduit dû au diamètre limité du tunnel, la grande sensibilité aux radiofréquences et la présence d’un fort champ magnétique. L’espace limité du tunnel et la sensibilité aux variations de susceptibilité magnétique ont conduit au développement d’HIFU avec une multitude de transducteurs, asservis par la phase, afin de réaliser l’ablation complète d’une tumeur en pilotant le faisceau ultrasonore par décalage du point focal, donc sans mouvement de l’HIFU. Cependant, avec la technologie actuelle, des signaux indépendants sont générés pour chaque élément de transduction par des générateurs très massifs à bande étroite. Les signaux de puissance sont envoyés au transducteur par des câbles coaxiaux individuels et une boîte d’adaptation d’impédance volumineuse. Avec l’augmentation du nombre d’éléments de transduction, le paquet de câbles devient très encombrant et source de pertes due à l’utilisation de micro-câbles coaxiaux. D’autre part, les risques d’interférences RF entre les nombreux signaux de puissance RF pilotant l’HIFU et l’acquisition de l’image IRM augmentent fortement. Idéalement, le système HIFU multiéléments idéal doit avoir : i) un grand nombre d’éléments de transduction pour adresser une large dynamique de contrôle du point focal, ii) un jeu de câbles léger pour un positionnement facilité du transducteur, iii) une large bande pour ajuster la fréquence de l’ultrason à la cible, iv) un système fiable de détermination de la position et de l’orientation du transducteur, et v) être compatible IRM. L’objectif du projet MRIgHIFU est de développer un système de contrôle, un transducteur multiéléments et un dispositif de localisation du transducteur afin d’adresser les verrous des technologies actuelles et de s’approcher du système HIFU idéal. Le prototype devra présenter les performances d’un système massivement multicanaux (>1000 éléments) s’intégrant parfaitement dans l’environnement IRM grâce : i) à l’intégration en technologie CMOS haute tension d’un circuit d’électronique de puissance avec son système d’adaptation d’impédance, le circuit étant directement placé dans le boîtier du transducteur HIFU, et ii) en équipant l’HIFU avec un système de pré-positionnement afin de faciliter son positionnement durant l’intervention. Ceci conduira à un système HIFU compact, beaucoup plus facile et sûr d’utilisation. A moyen terme, il sera possible d’avoir un très grand nombre de canaux et d’augmenter significativement la dynamique de déflexion du faisceau ultrasonore. Ceci offrira de nouvelles opportunités telles que le suivi d’organes mobiles. La validation du prototype développé sera réalisée sur la plateforme IRIS d’ICube (http://plateforme.icube.unistra.fr/iris) par des essais précliniques sur fantômes puis sur animaux.

Dans l'unité de soins intensifs (USI), la ventilation mécanique soulage le travail des muscles respiratoires, notamment du diaphragme, le principal muscle de l’inspiration. La ventilation mécanique assure des échanges gazeux adéquats mais peut produire des effets néfastes qui sont associés à une augmentation de la mortalité, de la morbidité et des coûts de santé. Le taux d'occupation des lits de soins intensifs en France est élevé (>80%) et toute stratégie visant à prévenir un séjour prolongé est cruciale et plus que jamais d'actualité dans le contexte de la pandémie de COVID-19. Éviter un effort insuffisant ou excessif du diaphragme est devenu un objectif essentiel dans la prise en charge des patients sous ventilation mécanique. Cette stratégie, appelée ventilation protectrice du diaphragme, ne peut être mise en œuvre sans outils fiables et facilement accessibles pour évaluer le diaphragme, et plus largement, les muscles inspiratoires et expiratoires accessoires. La surveillance des muscles respiratoires au sein de l’USI est complexe et les méthodes de référence reposant sur la mesure de la pression transdiaphragmatique sont invasives, peu disponibles et nécessitent une forte expertise. Ainsi, l'imagerie ultrasonore (US) suscite un intérêt croissant pour l'évaluation des muscles respiratoires. Cependant, l'échographie est très dépendante de l'opérateur tant pour l'acquisition, le traitement que pour l'interprétation des images. De plus, les équipes d’USI ne peuvent s’appuyer que sur un nombre très limité de biomarqueurs axés sur le diaphragme. Par ailleurs, ces biomarqueurs sont basés sur des mesures de distance effectuées manuellement et sont sujets à une grande variabilité. Enfin, les équipes utilisent le plus souvent des échographes sur chariot qui encombrent les chambres d’USI. Au cours de la dernière décennie, de nouvelles méthodes d'échographie basées sur des acquisitions ultrarapides (>1.000 images/s) ont été développées. Ces nouvelles approches permettent la découverte de biomarqueurs supplémentaires pour évaluer la structure, la composition et la fonction des muscles respiratoires. Par exemple, nous avons récemment montré que l'élastographie ultrasonore par ondes de cisaillement peut être utilisée pour évaluer les changements de la rigidité du diaphragme afin de mesurer son effort. Néanmoins, les applications des approches ultrasonores ultrarapides dans les muscles respiratoires sont complexes et nécessitent des développements spécifiques. À ce jour, la plupart de ces techniques avancées restent limitées aux environnements de recherche. Ainsi, l'absence de solutions technologiques spécifiques limite le potentiel et la diffusion de l’imagerie ultrasonore pour l'évaluation des muscles respiratoires au sein et au-delà de l’USI. Afin de surmonter ces limitations, un nouveau concept d'imagerie ultrarapide, ultraportable et dématérialisée a été récemment introduit. Cette approche induit un changement de paradigme en dépassant les limites inhérentes à la miniaturisation du matériel et ouvre de nouveaux horizons pour l’analyse d’image, en faisant notamment appel à l’intelligence artificielle. Il s'agit d'une occasion unique d’implémenter des biomarqueurs ultrasonores de qualité supérieure dans un facteur de forme ultraportable. En s’appuyant sur cette plateforme et sur les avancées récentes dans le domaine des ultrasons ultrarapides, ce projet vise à développer une solution ultraportable spécialement conçue pour l'évaluation de la structure et de la fonction des muscles respiratoires. La solution développée fournira une aide pendant les acquisitions, des biomarqueurs innovants et améliorera la robustesse des biomarqueurs existants. Nous utiliserons ce nouvel outil pour améliorer les connaissances sur la structure et la fonction des muscles respiratoires, avec l’objectif final d’optimiser la prise en charge de ces patients hospitalisé en USI.

La technique d'imagerie "Line-Field Confocal Optical Coherence Tomography" (LC-OCT), inventée par A. Dubois (coordinateur du projet), est valorisée par l'entreprise DAMAE Medical pour le diagnostic non invasif précoce des cancers cutanés. Un dispositif LC-OCT portable a été mis sur le marché en 2020. Basée sur la combinaison de la microscopie confocale et de l'OCT, cette technique permet d'imager la peau en profondeur (jusqu'à 0,5 mm) avec une résolution cellulaire (1 um). Le projet consistera à coupler à la LC-OCT des modalités de spectroscopie basées sur les phénomènes de diffusion Raman, d'auto-fluorescence et de réflexion diffuse. Grâce aux informations fournies par l'analyse fonctionnelle de la lésion, le diagnostic ne sera pas uniquement basé sur une appréciation visuelle. La combinaison de mesures spectroscopiques et d'informations morphologiques à haute résolution obtenues in situ au moyen d'un dispositif portatif devrait révolutionner la prise en charge médicale du cancer de la peau tout en réduisant les coûts de santé.

Des études épidémiologiques récentes font état d'environ 4 millions de décès par an dans le monde pour les maladies pulmonaires inflammatoires, qui sont l'asthme, la bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO), la fibrose pulmonaire et certains stades tardifs de l'infection par le COVID-19. Ce chiffre, comparé aux 1.8 million de décès dus à l'infection par le SRAS-CoV-2 en 2020, souligne l'impact actuel des maladies pulmonaires inflammatoires dans le monde. Aujourd'hui, les progrès des formulations sous forme d’aérosol et des dispositifs d'inhalation ont permis de faire des avancées dans le traitement de ces pathologies. Cependant, les données mentionnées précédemment montrent que des traitements innovants sont encore nécessaires, notamment pour améliorer l'efficacité de l'administration localisée des médicaments dans les poumons. Les bénéfices attendus auront un impact majeur sur le résultat clinique des patients, en ralentissant la progression de la maladie ou en retardant l'utilisation de traitements multiples en cas d’aggravation. MucOnChip relève un défi de santé publique en proposant une approche originale du criblage des formulations de médicaments anti-inflammatoires destinés à être administrés par inhalation dans les poumons. Pour cela, il est nécessaire de surmonter un obstacle conceptuel commun à la plupart des thérapies à base d’aérosols inhalés. D'une part, la taille optimale des particules pour les vecteurs médicamenteux ciblant la région bronchique est d'environ 1-5 µm et d'autre part, les microcavités du mucus sont telles que les particules de médicaments sont arrêtées et éliminées par le mécanisme de défense de la clairance mucociliaire. Le contournement du mécanisme de défense mucociliaire dans les poumons par l'utilisation d’agents thérapeutiques intelligents est au cœur de notre projet, et son succès pourrait ouvrir des portes pour le traitement de troubles pulmonaires au-delà des pathologies évoquées. Dans ce projet, nous concevons des agents thérapeutiques à base de corticostéroïdes combinant les avantages des nano- et microparticules, c'est-à-dire que par inhalation, ces microparticules se déposeront principalement dans les bronches et se dissoudront au contact du mucus, ce qui entrainera une libération de nanoparticules de corticostéroïdes capables de diffuser à travers le mucus et d'atteindre l’épithélium bronchique. La deuxième contribution importante du projet est que ces agents thérapeutiques synthétisés seront testés dans des conditions proches de la vie réelle sans passer par des études sur petit animal. Pour cela, nous fabriquerons une micropuce capable d'induire le transport de mucus à sa surface, comme dans les bronches, et nous étudierons in situ, à l'aide de la microscopie optique, comment les particules de médicament transloquent à travers la couche de mucus. Le dispositif microfluidique mimant la clairance mucociliaire qui sera développé ici est complémentaire des expériences réalisées In Vitro sur des épithéliums pulmonaires et In Vivo sur des petits animaux. Il présente par ailleurs des avantages importants: il ne nécessite pas d'environnement spécifique de biologie cellulaire, il est plus éthique et son coût est très compétitif. Ces différences devraient rendre notre technique très attractive pour de nombreux acteurs du domaine, notamment ceux de l'industrie pharmaceutique et des nanotechnologies. Plus généralement, MucOnChip aura un impact sur notre compréhension de l'interaction des microparticules et du criblage des médicaments avec le système de clairance mucociliaire, ce qui est d'une importance cruciale pour le développement de la nanomédecine pulmonaire. Ces connaissances ont donc de grandes chances d'avoir des applications industrielles en développant des systèmes innovants pour des produits médicaux et industriels pertinents.

Les nématodes phytoparasites ont un impact majeur sur la production alimentaire mondiale, avec un coût annuel estimé à environ 100 milliards d'euros dans le monde. Les nématodes à galles (Meloidogyne spp.) sont à eux seuls responsables de 5 % des pertes mondiales de récoltes. Ces agents pathogènes des racines présents dans le sol ont une répartition mondiale, peuvent infecter la plupart des plantes cultivées et sont particulièrement nuisibles pour les plantes maraichères (tomate, poivron et concombre). Pendant des décennies, des agents de lutte agrochimique des agents de lutte chimique (nématicides) à large spectre ont été utilisés. En raison de leur toxicité et de leur impact nocif sur l'environnement, la plupart de ces pesticides ont été ou seront interdits dans le monde entier. De nouvelles stratégies de lutte doivent être développées pour répondre à la demande des consommateurs qui souhaitent une production alimentaire plus sûre et des approches environnementales plus durables. Les résistances naturelles des plantes sont une alternative efficace aux pesticides pour contrôler les nématodes. Cependant, seuls quelques sources de résistance ont été identifiées dans un nombre limité de plantes cultivées et un nombre croissant de populations de nématodes ont déjà contourné ces résistances de l'hôte. Le projet MASH permettra d'acquérir une connaissance approfondie des processus biologiques manipulés par les nématodes à galles qui sont essentiels au développement de la maladie, et pourrait conduire à l'élaboration de nouvelles stratégies de lutte. Au cours de l'infection, les nématodes à galles sécrètent un cocktail de molécules, appelées effecteurs, qui induisent des cellules nourricières multinucléées spécialisées, appelées cellules géantes, essentielles au développement et à la reproduction du nématode. Les analyses du transcriptome ont révélé une reprogrammation majeure de l'expression des gènes pendant la formation de ces cellules géantes, associée à une régulation étroite de la division nucléaire, de la croissance cellulaire et des voies des hormones végétales. Récemment, il a été démontré que les nématodes à galles modulent un processus appelé épissage alternatif dans les cellules géantes de la plante modèle Arabidopsis. L'épissage alternatif permet à un ARN messager (ARNm) précurseur de générer non seulement un, mais deux ou plusieurs ARNm matures, donnant lieu à un ensemble de séquences d'ARNm provenant d'un seul gène parental. Cela se produit en réarrangeant les introns et/ou les exons. L'épissage alternatif contribue largement à la régulation de l'expression des gènes et à la diversité du protéome, en particulier lors de l'adaptation des plantes aux stress. Le projet MASH vise à mieux comprendre les réponses des plantes à l'infection par le nématode à galles en se concentrant sur le troisième légume le plus consommé au monde, la tomate. Nos objectifs sont (i) d'étudier la prévalence des changements d'épissage alternatif à l'échelle du génome pendant l'infection par le nématode à galles, (ii) de caractériser les effecteurs nucléaires conservés et sécrétés par les nématodes à galles qui modulent l'épissage alternatif, et (iii) d'identifier et de caractériser fonctionnellement les cibles végétales des effecteurs régulateurs de l'épissage et les gènes clés régulés par l'épissage alternatif. MASH est un projet multidisciplinaire incluant la bioinformatique, l’ARNomique et la phytopathologie. MASH devrait améliorer considérablement nos connaissances sur le rôle de l'épissage alternatif dans les réponses des plantes aux nématodes phytoparasites. La caractérisation des gènes de plantes cibles essentiels à l'infection par les nématodes à galles et l'identification de mutants/variants réduisant l'infection par ces nématodes, pourraient fournir des stratégies de contrôle innovantes contre ces ravageurs.

Les éléments transposables (ET) sont des composants majeurs des génomes eucaryotes et supposés jouer un rôle dans l’adaptation des populations à leur environnent. Contrairement aux nombreuses informations disponibles sur les espèces cultivées annuelles, le rôle des ET dans l'adaptation des espèces cultivées pérennes, tels que les arbres fruitiers, a été moins étudié. Pourtant, la domestication des espèces pérennes est supposée suivre des processus évolutifs différents de ceux des annuelles, avec des attendus génétiques distincts. Le projet PLEASURE comparera le polymorphisme des ET et leur impact sur l’expression des gènes dans des paires de populations cultivées-sauvages de quatre arbres fruitiers (pommier, poirier, abricotier, amandier). Ce projet ambitieux qui combine génomique et approches expérimentales générera des résultats originaux sur le rôle des ET dans l'adaptation des populations aux changements environnementaux, sans compter les conséquences appliquées des résultats.

Les plantes ajustent en permanence leur développement en réponse aux variations des paramètres environnementaux, qu’ils soient aériens ou dans le sol. Comment perçoivent-elles et intègrent-elles des signaux extérieurs simultanés aux conséquences variées sur la croissance ? Cette question constitue le cœur du projet NitReST, dans lequel je vais m’intéresser à l’interaction entre la nutrition des plantes et les réponses à la lumière ou la température. L’azote est un nutriment essentiel à la croissance végétale. En climat tempéré, dans des sols aérés, les ions nitrates (NO3-) sont la principale source d’azote pour les plantes, et les racines sont exposées à de grandes variations de la disponibilité du nitrate. Pour assurer de bons rendements, les sols agricoles sont souvent fertilisés par des engrais nitrés en excès. Cependant, un tel excès n’est que transitoire à cause de l’absorption par les racines et le lessivage, qui peut avoir de graves conséquences environnementales. Il est donc essentiel de comprendre comment la disponibilité en nitrates affecte le développement des plantes, en particulier dans des environnements non favorables. L’ombre causée par des plantes voisines représente un bon exemple de conditions sub-optimales. Certaines espèces comme Arabidopsis thaliana répondent à la présence des compétiteurs en allongeant leurs organes aériens (hypocotyle, tige) au profit de la croissance racinaire. Cette réponse, appelée évitement de l’ombre, favorise le positionnement des organes photosynthétiques en hauteur et une meilleure capture des rayons lumineux. De la même façon, une légère augmentation de température comme celle associée au changement climatique induit une réponse développementale appelée thermomorphogenèse, pour laquelle les phénotypes associés ainsi que les voies de signalisation sont très similaires à l’évitement de l’ombre. Cependant, les températures élevées favorisent l’élongation des racines. Cette différence peut avoir un impact significatif sur l’absorption des nutriments dans les deux contextes environnementaux. Le projet NitReST a pour ambition d’étudier comment les plantes intègrent nutrition azotée par les nitrates et réponses à l’ombre ou à une température élevée en répondant à deux questions complémentaires. D’une part, comment les conditions de lumière/température influencent-elle l’absorption, le transport et l’assimilation des nitrates dans les jeunes plantules ? Je propose de combiner des analyses métabolomiques à une approche de génétique inverse afin de (1) comprendre la régulation des différentes étapes de l’homéostasie du nitrate par l’ombre ou la température et (2) identifier des acteurs clés des voies du nitrate impliqués dans ces réponses de croissance. D’autre part, comment la disponibilité en nitrates influencent-elle l’élongation de l’hypocotyle et de la racine en réponse à l’ombre ou la température ? Un phénotypage approfondi des plantules avec des traitements combinés sera complété par deux approches complémentaires (transcriptomique et études d’association) qui permettront de décrire la variation naturelle et d’identifier des régulateurs importants de cette interaction. L’une des originalités de NitReST réside dans l’utilisation combinée de plusieurs espèces de la famille des Brassicacées : Arabidopsis thaliana, comme modèle principal, ainsi que Brassica rapa et Cardamine hirsuta. Ces dernières sont des espèces proches d’Arabidopsis pour lesquelles on dispose du génome séquencé et de la possibilité d’obtenir des mutants par la technique CRISPR. De plus, elles présentent des réponses contrastées à l’ombre et à la température. Cela permettra de mieux comprendre comment l’apport en nitrates affecte des espèces avec des stratégies variées. Les résultats du projet NitReST auront un fort impact à la fois en recherche fondamentale et appliquée et apporteront de nouvelles perspectives sur comment mieux utiliser les engrais nitrés en agriculture dans le contexte du changement climatique.

Les graines jouent un rôle clé dans la dissémination et l'évolution des plantes, ainsi qu’en agriculture et pour la production alimentaire. Comprendre les mécanismes qui contrôlent le développement des graines, permettant de mettre en pause la croissance de l'embryon et d'accumuler des composés de réserve, est donc une question fondamentale en biologie végétale. Les transitions entre les différentes phases du développement des graines (c'est-à-dire l'embryogenèse, la maturation et la germination) et le bon déroulement de la maturation sont contrôlés par les régulateurs transcriptionnels LAFL, qui sont conservés chez les angiospermes, à savoir LEC1, ABI3, FUS3, et LEC2 chez Arabidopsis. Ils peuvent former différents complexes protéiques qui initient et maintiennent le développement et la maturation de l'embryon, tout en réprimant sa germination. Ainsi, le réseau LAFL contrôle le développement et la qualité des graines, ainsi que le rendement. Conformément à leur rôle clé, l'expression des gènes LAFL est strictement contrôlée par de nombreux mécanismes transcriptionnels et chromatiniens impliquant notamment le complexe PRC2 (une histone H3 lysine 27 méthyltransférase) conservé au cours de l'évolution et jouant un rôle clé dans l’achèvement de la phase embryonnaire. De plus, il a été récemment suggéré que les LAFL pourraient eux-mêmes participer aux modifications de la chromatine, en agissant comme des " facteurs pionniers " et recrutant des régulateurs chromatiniens qui restent à caractériser. Malgré leur rôle central, nous ignorons encore comment les LAFL et les modifications de la chromatine interagissent pour contrôler à la fois les transitions de phases et la maturation des graines. Nous pensons que la régulation de l'expression des gènes LAFL par des mécanismes chromatiniens, les effets pléiotropiques de leurs mutations et la difficulté d'accéder à l’embryon et l’albumen au sein de la graine ont fait obstacle à l’élucidation des mécanismes impliqués et ont masqué le fait que les LAFL pourraient eux-mêmes influencer l'état de la chromatine. Une autre limitation réside dans la petite taille de la graine et la difficulté d'accéder aux différents tissus qui la composent. Par conséquent, il est crucial d'utiliser de nouvelles approches pour suivre la dynamique de la chromatine et du transcriptome dans les différents tissus de la graine, au cours de son développement. De plus, afin d'élucider les relations épistatiques entre les LAFL et les régulateurs de la chromatine, nous devons développer de nouveaux allèles inductibles permettant d'activer ou de réprimer précisément l’expression de ces gènes et découpler l'expression des gènes LAFL des régulations chromatiniennes. L'objectif du projet est donc de développer des approches et des outils originaux pour identifier de nouveaux régulateurs et élucider comment les LAFL interagissent avec les régulations chromatiniennes pour contrôler le développement et la maturation des graines. Les résultats de ce projet seront à la fois scientifiques et techniques. En effet, nous utiliserons des techniques de pointe récemment adaptées dans nos laboratoires, nous générerons des allèles inductibles originaux et spécifiques à un tissu, et nous modifierons l'épigénome des LAFL en utilisant une nouvelle approche CRISPR/dCas9. L'utilisation d'Arabidopsis sera essentielle pour réaliser ces analyses. Le principal résultat scientifique de ce projet consistera en une connaissance des mécanismes génétiques et moléculaires qui contrôlent le développement et la maturation des graines. Au-delà des graines, le projet contribuera à mieux comprendre les mécanismes fondamentaux qui contrôlent les transitions de phase au cours du développement des plantes. Enfin, étant donné que les LAFL et les régulateurs chromatiniens sont largement conservés chez les espèces cultivées, ce projet a des impact potentiels importants en agriculture.

Les échanges réciproques d'ADN entre chromosomes homologues parentaux, les cross-overs (COs), sont initiés par l'induction programmée de centaines de cassures double brin (CDB) de l'ADN par méiocyte pendant la prophase de la méiose. Notamment chez les plantes à fleurs, ces échanges restent cependant limités du fait que seul un nombre réduit de CDBs sont réparés en COs, en général 1 à 3 par paire de chromosomes homologues. De plus, les COs sont distribués de manière inégale le long des chromosomes ce qui peut limiter l'accès à des combinaisons d'allèles bénéfiques lors des croisements en amélioration des plantes. Les facteurs régulant la localisation des DSB d’une part et des CO d’autre part, identifiés chez la plante modèle Arabidopsis, sont respectivement l'accessibilité de la chromatine pour la machinerie d'induction et de prise en charge des DSB, qui comprend le complexe transestérase SPO11, et la réussite de la recherche d'homologie et de la synthèse d'ADN sur la molécule d'ADN homologue envahie. De mieux comprendre les facteurs qui influencent la recombinaison méiotique, notamment chez les grands génomes des plantes cultivées, est donc d'une importance capitale, tant du point de vue fondamental qu'appliqué. Le projet LANDSREC rassemble des partenaires apportant leur expertise en biologie cellulaire, épigénétique, génétique et bioinformatique afin de fournir aux généticiens et aux sélectionneurs une vue d'ensemble des différents paysages génomiques en interaction régulant la production de descendances recombinantes chez le riz asiatique (Oryza sativa L.), un génome modèle de plante et une culture d'une importance cruciale pour la sécurité alimentaire. Dans ce but, LANDSREC utilisera un génome hybride inter-subspécifique indica/japonica particulièrement bien adapté et caractérisé pour cette étude et représentant une diversité de situations de variations épigénomiques, structurelles et nucléotidiques, pour établir pour la première fois : i. le paysage épigénomique (méthylation de l'ADN, modifications des histones et dépôt de variants, structures en R-loop) dans les sacs de méiocytes mâles purs isolés en prophase de la méiose, qui sera comparé à celui des tissus somatiques (WP1) ; ii. le paysage des CDBs à haute résolution, résultant du séquençage d'oligonucléotides restant liés de manière covalente à SPO11 (WP2) ; iii. le paysage de la recombinaison (COs) à haute résolution établi à partir de données de séquences déjà disponibles de 2,000 plantes F2 (WP3) ; iv. un modèle prédictif basé sur les dissimilitudes structurelles et de séquences entre les parents permettant d'établir l'influence de ces variations sur le succès de la réparation de la CDB en CO dans une région chromosomique donnée et de tester plus avant sa validité sur d'autres types de matériel végétal (population F2 mutante hyper-recombinante recq4 et populations de lignées recombinantes de Nested Association Mapping)(WP3) v. un outil de visualisation de la probablité de CO basé sur ce modèle prédictif et intégré dans un navigateur génomique existant, le rice genome hub, qui affichera également toutes les informations de séquences de LANDSREC (WP4). Pour conclure, LANDSREC abordera les questions cruciales suivantes : i. quels facteurs épigénomiques spécifiques au contexte de la prophase de la méiose influencent la localisation des HS des CDB ; ii. dans quelle mesure les HS des DSB sont corrélés aux HS des CO ; iii. dans quelle mesure les variations structurelles et de séquences nucléotidiques inter-parentales influencent la réparation des DSB dans les CO. iv. est-il possible de construire un modèle prédictif de l'occurrence de CO dans un génome hybride uniquement basé sur les variations structurales et nucléotidique inter-parentales et fournissant éventuellement aux généticiens et aux sélectionneurs une probabilité d'obtenir des recombinants dans une région chromosomique dans n'importe quelle combinaison hybride, à condition que leurs parents soient séquencés.

Bien que les changements climatiques mondiaux affectent considérablement le rendement des récoltes agricoles, notre compréhension des mécanismes cellulaires impliqués dans la tolérance des plantes aux stress environnementaux demeure encore limitée. L’accumulation transitoire de triacylglycérols (TAG) dans des organites appelés corps lipidiques (CL) est un mécanisme cellulaire considéré comme essentiel dans l’adaptation au stress. Chez les plantes, un large éventail de stress environnementaux, dont la chaleur et la carence en azote, induisent l'accumulation de TAG et la prolifération des CL. Mais par quelles voies, lipolyse ou lipophagie, sont dégradés ces lipides et comment contribuent-ils à l’homéostasie membranaire et énergétique ? Coexiste-t-il au sein des cellules des populations distinctes de CL avec des fonctions spécifiques associées à la fourniture d’énergie ou au remodelage des membranes et organites ? Le projet RecovOil, d'une durée de 4 ans, propose un programme expérimental transdisciplinaire afin d'aborder ces questions et élucider les fonctions des CL lors de la récupération post-stress. Le projet vise notamment à caractériser les mécanismes de remobilisation des CL et leur importance dans la tolérance des plantes aux stress, en déterminant si ces mécanismes sont spécifiques du type de stress (chaleur vs carence en azote) et du stade de développement (jeunes plantes adultes vs jeunes plantules) ? Pour répondre à cette dernière question, trois systèmes expérimentaux seront étudiés tout au long du projet: la plantule d’Arabidopsis thaliana après une carence en azote, la plantule après un stress thermique, et la graine germée après un stress thermique. Globalement, le projet RecovOil est divisé en trois ensembles de travaux scientifiques, qui fourniront des résultats indépendants et intégrés selon les trois objectifs suivants : (1) comprendre comment les CL contribuent aux adaptations du métabolisme lipidique et à l’homéostasie membranaire lors de la phase de récupération post-stress ; (2) identifier les populations de CL et leur dynamique pendant cette phase ; (3) identifier et caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la dégradation des CL et la remobilisation des lipides. En agrégeant l'expertise scientifique complémentaire de quatre équipes de recherche, portant sur la biologie des CL, le métabolisme lipidique, le stress et l'autophagie, ce projet mobilisera une combinaison d'approches de pointe alliant la lipidomique, la fluxomique, la protéomique à la biologie cellulaire/moléculaire et à la physiologie végétale pour caractériser les voies et les mécanismes moléculaires sous-jacents à la dégradation des CL et leur pertinence métabolique et physiologique pendant la récupération post-stress. Ce projet contribuera ainsi à mieux comprendre comment les plantes s’adaptent aux stress environnementaux, une question cruciale dans le contexte actuel des changements climatiques mondiaux.

L'importance de l'excrétion hétérogènes dans le contexte des maladies infectieuses est désormais bien documentée et reconnue. Les individus infectés qui hébergent et excrètent un agent pathogène donné à des concentrations plus élevées que leurs congénères sont souvent appelés super-excréteurs, par opposition aux individus faible-excréteurs. Ces super-excréteurs ont un taux de transmission beaucoup plus élevé et constituent une cible clé pour les études épidémiologiques et la gestion de maladies telles que la salmonellose pour laquelle les volailles constituent la principale source de contamination humaine. Cependant, les conditions qui favorisent ces phénotypes super et faible excréteurs sont mal comprises. Cela est cependant une condition préalable pour contrôler les réservoirs de contamination au sein d'une population ou d’un élevage. Sachant que l'émergence des phénotypes super et faible excréteur est prédéterminée par le microbiote intestinal et a été observée chez diverses espèces animales élevées dans des environnements distincts et avec des compositions de microbiote intestinal étonnamment diverses, nous avons émis l'hypothèse que si différents taxons bactériens peuvent conduire à des résultats similaires en termes d'excrétion hétérogène, des points communs fonctionnels et taxonomiques potentiels dans l'intestin devraient conduire à ces phénotypes. Ainsi, sur la base de données préliminaires, l'excrétion hétérogène semble dépendre d'une combinaison (1) de caractéristiques spécifiques du microbiote intestinal (2) de la réponse immunitaire en particulier de la muqueuse (3) d’un dialogue complexe via les métabolites bactériens et de l’hôte et (4) plusieurs effets stochastiques, y compris le rythme et le succès de la colonisation intestinale par les micro-organismes environnementaux. En revanche, nous avons montré que la génétique de l'hôte et la modification de la virulence bactérienne ne jouent pas un rôle majeur dans cette étape. Dans ce projet, nous étudierons les causes de l'excrétion hétérogène de Enteritidis chez le poulet. Sur la base de différentes conditions connues pour favoriser l'un de ces phénotypes par la modification de la composition du microbiote intestinal, nous comparerons les caractéristiques spécifiques du microbiote intestinal, de la réponse immunitaire muqueuse et systémique et le dialogue complexe induit par les métabolites dans l'intestin. Le projet MOSSAIC, organisé en six tâches, a trois objectifs principaux : - Fournir une meilleure compréhension et plus intégrée du phénomène de l'excrétion hétérogène ; - Modéliser les interactions des partenaires biologiques du "ménage à trois": Salmonella-réponse immunitaire de l'hôte-microbiote intestinal, en tenant compte de leurs métabolites ; - Confirmer, à l'aide de plusieurs expériences in vitro et in vivo, certaines hypothèses suggérées par les analyses de données et les modèles mathématiques. La faisabilité de notre projet est basée sur un modèle original d'infection en isolateur, qui nous permet d'identifier clairement les phénotypes super- et faible excréteurs en contrôlant les contaminations entre animaux. Par ailleurs, le projet MOSSAIC réunit 5 partenaires aux expertises complémentaires indispensables à la réalisation du programme de travail : bactériologie, infection animale, immunologie et métabolisme aviaire, métabolomique, bioinformatique et modélisation. Dans une perspective à long terme, les connaissances acquises au cours du projet serviront de base au développement de communautés bactériennes, qui pourraient être apportées aux poussins afin de standardiser leur microbiote intestinal et d'augmenter leur résistance aux pathogènes dans la filière volaille.

Les légumineuses peuvent établir avec les rhizobia une symbiose fixatrice d’azote palliant le besoin en engrais azoté de la plante. Cette interaction aboutit à la formation de nodosités racinaires où les rhizobia fixent l'azote atmosphérique pour la plante. En plus de cette interaction classiquement étudiée, les nodosités peuvent être induites par des rhizobia non-fixatrices et/ou être colonisées par des bactéries non-rhizobia. Les déterminants symbiotiques et immunitaires gouvernant ces interactions sont méconnus. Nous avons isolé de nodules une bactérie atypique (Ensifer adhaerens T4) qui se comporte comme un agent pathogène ou induit des nodosités chez la même espèce, Medicago truncatula. L’issue de l’interaction dépend de l’âge de l’hôte. T4 peut également co-coloniser des nodosités induites par une autre souche. Le projet PATHOSYM permettra de mieux décrire les interactions pathogène et symbiotique-like de ce système, puis en intégrant les données génomiques (séquence du génome de T4 connue) et physiologiques de la souche, construire un modèle du fonctionnement du génome de T4. Ce model sera confronté aux données omics produites lors du projet pour prédire les gènes clés de l’interaction T4-Medicago. Nous construirons les mutants de ces gènes pour valider le modèle. Nous étudierons aussi la réponse de la plante lors des interactions symbiotique-like et pathogène avec la souche T4. Le projet PATHOSYM vise donc à décrire les bases moléculaires des interactions T4-M. truncatula pour comprendre les comportements contrastés de T4 et voir comment la plante différencie agents pathogènes et symbiontes.

La sélection bovine a permis une amélioration considérable des performances des bovins laitiers en quelques décennies, alors qu’une grande part de la variance phénotypique reste inexpliquée. POLYPHEME explorera les interactions entre polymorphismes de séquence et méthylation de l'ADN chez le bovin, dans le but de proposer de nouvelles stratégies de sélection. Nous aborderons (i) le contrôle génétique de la méthylation de l’ADN, avec l’identification de « quantitative trait loci » de méthylation (meQTL), (ii) la corrélation de la méthylation de l’ADN, sous contrôle génétique ou non, avec les performances propres ainsi que celles de la descendance, (iii) le rôle de la méthylation de l’ADN dans la dynamique et la stabilité du génome bovin, à travers l’identification de néo-mutations et de sites de recombinaison dépendants de la méthylation. POLYPHEME rassemble 3 partenaires complémentaires en termes d’expertise et d’accès aux ressources biologiques et aux plateformes : INRAE BREED (méthylation de l’ADN), INRAE GABI (génomique/génétique quantitative), ALLICE (prédiction de la fertilité, accès aux taureaux commercialisés). POLYPHEME aura pour objet d'étude la semence bovine, car le méthylome spermatique est crucial pour la fertilité mâle et pourrait également avoir un impact sur le développement embryonnaire ainsi que sur le phénotype de la descendance. De plus, la méthylation de l’ADN est relativement stable dans la lignée germinale mâle, suggérant que le méthylome spermatique pourrait refléter la méthylation de l’ADN au moment où la recombinaison homologue prend place et où les mutations transmises à la génération suivante apparaissent. Pour (i), les méthylomes spermatiques de 500 taureaux seront analysés par « reduced representation bisulfite sequencing » et des études d’association au niveau de la séquence complète seront menées pour identifier les meQTL. La concordance des meQTLs et des performances mesurées sur les taureaux (fertilité) ainsi que sur leurs filles sera examinée. Pour (ii), les effets épigénétiques multi-générationnels seront distingués de la méthylation sous contrôle génétique, donc héritable, par le biais de variations intra-individuelles du méthylome spermatique corrélées aux performances de la descendance. Un modèle de génétique quantitative étendu à l’épigénétique sera ensuite appliqué pour explorer l’impact de la méthylation spermatique sur les phénotypes. Pour (iii), les mutations récentes et les évènements de recombinaison homologue seront identifiés chez 40 vaches soigneusement sélectionnées dérivant à 95% de 40 ancêtres dont elles sont séparées par 4-6 générations. Nous déterminerons ensuite si le taux de mutation des CpG et la fréquence de recombinaison homologue dépend du statut de méthylation dans la lignée germinale des ancêtres. Les retombées de ce projet seront avant tout fondamentales, mais il utilisera des ressources générées par la sélection bovine et les résultats en découlant faciliteront l’interprétation biologique de la masse de QTL identifiés jusqu’à présent. De plus, la connaissance des mécanismes génétiques pilotant les variations héritables du méthylome pourrait permettre de sélectionner une population bovine présentant une plasticité génomique accrue, ce qui pourrait constituer un avantage dans le contexte actuel de changement climatique et d’instabilité environnementale. Enfin, quel que soit le volume de données traité, les études d’associations ne permettent d’expliquer qu’une partie des caractères physiologiques complexes et des maladies. Les mécanismes moléculaires sous-tendant cette « héritabilité manquante » ne sont pas connus, mais l’intervention de processus épigénétiques dans ce phénomène est une hypothèse plausible. L’intégration de ces processus épigénétiques transmissibles aux méthodes d’évaluation génomiques pourrait constituer une innovation de rupture qui révolutionnerait le monde de l’élevage.

Orobanche cumana est une plante parasite obligatoire qui infecte le tournesol, entrainant des pertes de rendement importantes. Les graines d’orobanche présentes dans le sol ne germent qu’en percevant des molécules exsudées par les racinaires du tournesol. Grâce aux ressources génétiques du genre Helianthus, nous avons identifié des accessions induisant ou non la germination. Des approches de génétique et de génomique identifieront des gènes candidats impliqués dans la biosynthèse des molécules inductrices. Une approche sans a priori sera aussi menée par fractionnement des exsudats racinaires de tournesols en analysant leur capacité germinative et leur composition moléculaire. Nous identifierons les récepteurs des molécules inductrices chez l’orobanche par des approches de biochimie fonctionnelle et analyserons leur diversité. Outre les connaissances fondamentales, ces résultats permettront de produire de nouvelles variétés de tournesol résistantes et méthodes de lutte.

Les plantes et leur capacité photosynthétique sont essentielles à la survie des animaux, tout comme les activités complémentaires de respiration qui ont lieu dans les mitochondries, qui affectent directement la productivité des cultures et l’adaptation aux changements environnementaux. La recherche sur la biogenèse des organelles est donc d’une importance stratégique majeure. La fonction des mitochondries dépend du maintien et de l’expression de son génome, l’ADNmt, ainsi que de la coordination étroite avec le génome nucléaire qui est essentielle à l’homéostasie énergétique, la vigueur des plantes et la réponse aux stress. Tous les génomes sont exposés à des stress environnementaux et métaboliques qui compromettent leur intégrité, et les cellules ont développé des points de contrôle, pour coordonner la progression du cycle cellulaire avec la réparation de l’ADN. Bien que ces mécanismes soient bien connus pour l’ADN nucléaire, ils ont été peu étudiés dans le compartiment génétique mitochondrial. Il s’agit d’un manque de connaissances majeur, car les organites en tant que centrales énergétiques de la cellule génèrent de grandes quantités de molécules génotoxiques, telles que les espèces réactives de l’oxygène (ROS), et leurs génomes sont donc particulièrement susceptibles d’accumuler des lésions. Le projet «Mitochondrial DNA Damage Response» (MIT2DR) vise à combler cette lacune. Le projet MIT2DR est fondé sur des résultats obtenus conjointement par P1 et P2, montrant que des défauts de croissance de mutants déficients dans la maintenance de l'ADNmt étaient corrélés à l'induction d'inhibiteurs de la progression du cycle cellulaire, apparemment en réponse à un pic de ROS. P1 a également observé des phénotypes similaires dans des lignées exprimant des endonucléases TALEN mito-ciblées, qui ont déjà été confirmées par P1 comme étant très efficaces et donc idéales pour l'étude des réponses induites par les dommages à l'ADNmt. En exploitant l'édition ciblée de l'ADNmt par des nucléases TALEN et des mutants d'Arabidopsis déficients pour la réparation de l'ADNmt, le projet propose de disséquer les cascades de signalisation rétrogrades (mitochondrie vers le noyau) régulant la réponse cellulaire aux dommages de l'ADNmt, et ainsi de déchiffrer comment les atteintes à l'intégrité de l'ADNmt affectent le développement des plantes. Le projet combinera des approches génomiques, génétiques, biochimiques et cytologiques de pointe. En combinant des approches de transcriptomique et de profilage de l’épigénome, ce projet permettra de décrypter les changements d’expression des gènes induits en réponse aux lésions de l’ADNmt et les modifications de la chromatine sous-jacents. Les réponses précoces seront étudiées à l'aide de la modification de l'ADNmt par des exonucléases TALEN inductibles. En utilisant des lignées rapportrices exprimant des biocapteurs fluorescents nous examinerons la cascade de signalisation des dommages causés par l'ADNmt, en explorant la production et la détoxification de ROS dans les plantes TALEN et dans les mutants de réparation de l'ADNmt. Enfin, le projet MIT2DR identifiera de nouveaux éléments de signalisation grâce à une approche de crible génétique. Le projet capitalise sur l'expertise complémentaire des deux partenaires: le partenaire P1 est un expert de l'expression génétique mitochondriale et un contributeur majeur dans le domaine de la recombinaison et de la réparation de l'ADNmt, tandis que le partenaire P2 a une vaste expertise dans l'analyse de la régulation et la progression du cycle cellulaire, à l'aide d'approches de cytologie et d'imagerie, et dans l'analyse de la méthylation de l'ADN et des modification de la chromatine par ChIP-seq.

Dans les plantes en C4, la séparation des fonctions photosynthétiques entre les chloroplastes du mésophylle (M) et de la gaine (BS) permet une fixation efficace de CO2. Les régulations d’expression génétique à l’origine de la différenciation en C4 restent inconnues. Toutefois, l’expression spécifique des complexes photosynthétiques comme le PSII dans le M ainsi que de la RuBisCO et NDH dans le BS suggère que les régulations C4-specifiques interviennent au niveau du nucléoïde. Les nucléoïdes regroupent des protéines impliquées dans toutes les étapes de l’expression plastidiale. Ce projet vise à révéler les protéines impliquées dans l’expression C4-specifique dans une approche comparative des nucléoïdes du M et BS, combinant la protéomique et transcriptomique. Ces approches permettront de révéler les protéines et les maturations post-transcriptionelles des ARNm impliqués dans la différentiation en C4. Les mécanismes d’action des protéines candidates seront explorés par génétique inverse

Les semences sont fondamentales pour l'agriculture et elles constituent une source alimentaire majeure pour les hommes et les animaux. Le changement climatique devrait avoir un impact considérable sur leur germination car la phénologie de la germination est étroitement contrôlée par les signaux de l’environnement. En particulier, le régime thermique au moment de la formation des semences sur la plante a un impact direct sur la dormance à la récolte, ce qui peut directement influencer la levée des semis et la productivité de tous les agrosystèmes. Le projet RNASEED associe les 3 partenaires suivants: Institut de Biologie Paris-Seine, Sorbonne Université (P1), Institut des Sciences Végétales Paris Saclay (P2), Institut Jean Pierre Bourgin (P3). Nous étudierons l'effet du régime thermique pendant le développement des semences d'Arabidopsis, principalement perçu via le métabolisme et la signalisation de l'hormone acide abscissique (ABA), sur leur dormance à maturité. L'objectif de RNASEED est de déterminer si l'effet de la température sur la dormance des semences peut être modulé par la régulation de l'expression génique par les ARN non codants, qui est une composante peu étudiée du transcriptome dans ce contexte. RNASEED s’appuiera tout d'abord sur les nombreuses données transcriptomiques préliminaires, disponibles auprès des P1 et P3, obtenues dans le cadre du projet européen ECOSEED, et qui suggèrent que les petits ARN et les ARN antisens jouent un rôle dans la régulation de la dormance. Ensuite, grâce à des outils génétiques, des analyses du transcriptome et du traductome nous produirons des données fondamentales sur les mécanismes contrôlant la dormance des semences qui permettront de concevoir un nouveau réseau moléculaire de régulation de la dormance intégrant l'action des petits ARN et des ARN antisens. En sus des approches de génétique et de génétique inverse pour moduler l’abondance d’ARN régulateurs dans les réseaux transcriptionnels, nous développerons également des technologies de nanoparticules afin de fournir ces ARN aux semences dormantes avec l'objectif de permettre leur germination. RNASEED est divisé en 4 work-packages (WP) intégrant analyse de données, approches expérimentales et transfert des connaissances vers des applications potentielles. En combinant l'exploration des données transcriptomiques issues du projet ECOSEED et la préparation de bibliothèques de petits ARN (WP1), nous construirons un réseau moléculaire qui intégrera le rôle des petits ARN dans la réponse à la température des semences en développement. L'analyse de ce réseau permettra d'identifier des ARNs, des ARN antisens ou des cibles présentant une fonction potentielle dans le contrôle de la perception de la température des semences en développement (WP2). Les candidats identifiés seront ensuite validés en modifiant leur expression dans les semences (délétion via CRISPR-cas9 ou surexpression) et en évaluant le phénotype de germination des semences ainsi obtenues (WP3). De plus, nous étudierons également leur rôle dans la traduction sélective qui contrôle la germination des semences (WP3). Enfin, RNASEED vise également à transférer les connaissances acquises vers des applications pratiques et nous essaierons de moduler la dormance grâce à l'utilisation de nanoparticules qui fourniront les ARN régulateurs identifiés aux semences (WP4). Nous développerons donc une technologie qui permettra d’incorporer les ANR dans des nanoparticules afin de les fournir aux semences dormantes par pelliculage ou par un traitement de prégermination dans le but de permettre leur germination en conditions non-optimales. Ainsi, RNASEED apportera de nouvelles connaissances dans la compréhension du rôle des ARN non codants dans la biologie des semences et il fournira de nouveaux outils technologiques pour moduler la dormance au moment du semis.