Stabilité Génétique, Cellules Souches et Radiations

La cohésine, un complexe protéique en forme d'anneau, est essentielle à la stabilité du génome en régulant les boucles d'ADN, l'expression des gènes, la cohésion des chromatides sœurs et la réparation de l'ADN. Elle forme des boucles intrachromosomiques pendant l'interphase, contribuant à l'organisation de la chromatine en rapprochant amplificateurs et promoteurs. La cohésine maintient également la cohésion des chromatides sœurs pendant la réplication de l'ADN et répare les cassures double brin (DSB). En réponse aux dommages à l'ADN, la cohésine se lie aux DSB et renforce la cohésion via la DI-cohésion. Récemment, il a été montré que la cohésine lie les extrémités des DSB grâce à des oligomères. Ce projet de recherche explore comment les dommages à l'ADN influencent les rôles de la cohésine dans la stabilité du génome. L’hypothèse centrale est que ces dommages activent des populations distinctes de cohésine avec des fonctions spécifiques, essentielles pour l’intégrité du génome. Utilisant Saccharomyces cerevisiae comme modèle, le projet vise trois objectifs : analyser l'impact des dommages sur la composition de la cohésine, étudier son oligomérisation dans l'attachement des DSB, et identifier les populations de cohésine impliquées dans la DI-cohésion. La méthodologie combine approches biochimiques, génétiques et génomiques. Les tâches clés incluent l’identification de nouveaux interacteurs de la cohésine, l’étude des complexes dans des mutants spécifiques, et l’analyse des modifications post-traductionnelles.

La réplication de l'ADN est constamment mise à l'épreuve par des dommages de l’ADN qui peuvent bloquer sa progression, entrainant un « stress réplicatif ». Ce stress réplicatif menace la stabilité du génome ainsi que la viabilité cellulaire et a été associé à diverses pathologies humaines. Les mécanismes de tolérance aux dommages à l’ADN peuvent contrer le stress réplicatif. L’un de ces mécanismes implique le redémarrage de la fourche de réplication en aval du dommage grâce à la synthèse d’une nouvelle amorce d’ADN (repriming) par la polymérase et primase PRIMPOL. Le repriming permet la progression de la fourche de réplication mais entraine la formation de brèches d’ADN simple brin post-réplicatives. Ces brèches sont ensuite comblées par des mécanismes tels que la synthèse translésionnelle et le changement de matrice (template switching). Malgré l’intérêt croissant pour les brèches post-replicatives formées en réponse à un stress réplicatif, les déclencheurs moléculaires du repriming aux fourches de réplication bloquées restent à définir. De plus, les déterminants du « choix » du mécanisme de comblement des brèches sont encore méconnus. Dans ce projet, nous visons à aborder ces questions fondamentales. A partir de nos données préliminaires, nous cherchons à comprendre l’impact (1) de la quantité et la nature des dommages à l’ADN, (2) des facteurs de réponse aux dommages de l’ADN et (3) de l’état de la chromatine sur la formation et le comblement des brèches post-réplicatives. Pour réussir ce projet, nous avons établi un consortium d’experts en réplication de l’ADN, en réponse aux dommages de l’ADN et en chromatine. Nous intègrerons des techniques de pointe de microscopie, de protéomique et des approches à l’échelle du génome. Ce projet est crucial pour comprendre comment les cellules répondent à un stress réplicatif et pour décrypter l’interaction complexe entre les réponses à un stress réplicatif et la chromatine.

Un couple sur six dans le monde connaît des problèmes d'infertilité, et l'infertilité masculine est responsable d'environ la moitié des cas, constituant ainsi un problème de santé publique. Tout au long de la vie reproductive, la spermatogenèse a pour origine un petit groupe de cellules souches spermatogoniales (SSC) qui peuvent s'auto-renouveler ou se différencier, subir la méiose et enfin la spermiogenèse pour produire des spermatozoïdes. Chez les patients qui suivent des thérapies à forte toxicité gonadique, l'un des principaux effets secondaires qui nuit à la qualité de vie après la guérison est l’atteinte du stock de SSC et les problèmes d'infertilité qui en résultent. Dans les modèles animaux, différentes approches dont la transplantation testiculaire de SSC ont montré leur capacité à restaurer complètement la spermatogenèse, offrant ainsi un véritable espoir thérapeutique dans le domaine de la fertilité humaine. Cependant, aucune thérapie cellulaire basée sur les SSC n'a été rapportée chez l'homme jusqu'à présent. Le manque de connaissances sur les SSC humaines est un frein à la compréhension du potentiel de régénération de ces cellules, nécessaire au développement d'une thérapie cellulaire de l'infertilité. Le faible nombre de SSC dans une seule biopsie limite l'efficacité du processus de régénération après transplantation testiculaire. L'amplification des SSC in vitro constitue une étape clé pour augmenter le nombre de cellules souches, mais les facteurs et conditions de culture permettant l'amplification in vitro des SSC humaines ne sont pas connus. Nous proposons ici de rechercher de nouvelles molécules permettant l’expansion in vitro des SSC humaines en utilisant une approche de criblage à haut débit et à haut contenu de bibliothèques de petites molécules et d'étudier les effets des composés identifiés sur les SSC dans un dispositif d’organe sur puce testiculaire.

La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme majeur de réparation des cassures double-brin (CDB) de l'ADN, conservé chez tous les organismes. Chez les eucaryotes, la RH dépend de la formation de filaments nucléoprotéiques de la recombinase Rad51 sur un ADN simple brin. Ces filaments permettent de scanner le génome à la recherche d’un ADN homologue qui est utilisé comme matrice pour la synthèse réparatrice. L'objectif du projet SafeHR est de définir les mécanismes à l’origine de la régulation de la formation, de la stabilité et de la dissociation des filaments Rad51 qui empêchent des événements de recombinaison toxiques non programmés de se produire. Ces mécanismes sont liés à l'action de régulateurs négatifs et positifs qui influent sur la dynamique des filaments Rad51. Récemment, le Partenaire 1 a montré que le facteur majeur de formation des filaments Rad51, Rad52, reste associé aux filaments et inhibe leur démantèlement par l’ADN hélicase Srs2. Les complexes constitués des protéines paralogues de Rad51, Rad55-Rad57 et SHU, sont également impliqués dans cette inhibition. Grâce à une approche multidisciplinaire de génétique, de biologie moléculaire, de biochimie, de structure des protéines et de microscopie et en utilisant la levure comme organisme modèle, notre consortium prévoit de définir la structure et la dynamique de l’association de ces protéines avec les filaments Rad51, afin de déterminer les mécanismes de régulation et la cause de leur toxicité potentielle. Notre consortium comprend quatre équipes qui travaillent dans les domaines de la réparation de l'ADN et de la RH en utilisant des approches complémentaires. Grâce aux approches structurales (modélisation, RMN, cristallographie et cryo-EM) et à la génétique, les partenaires 1 et 2 ont initié la caractérisation de l'assemblage de Rad52, Rad55-Rad57 et SHU au sein des filaments Rad51. Ces études seront poursuivies en collaboration avec le partenaire 4 par des approches de biologie structurales intégratives. Cette stratégie nous permet dès à présent de concevoir des mutations qui affectent des interactions spécifiques et d'évaluer précisément le rôle de chacune de ces interactions. Ceci constituera une avancée considérable par rapport aux études précédentes qui ont utilisé des approches de délétion complète de gènes. Associées à la construction d’une protéine de fusion Rad51-GFP par les Partenaires 2 et 3, qui pour la première fois permet l’étude par microscopie de filaments Rad51 fonctionnels in vivo, ces mutations nous permettront de déterminer le rôle de Rad52 et des différents paralogues de Rad51 dans la RH induite par les CDBs ou par des cassures simple brin d’ADN (CSB). Cette stratégie permettra également de comprendre les mécanismes d'inhibition de l'hélicase Srs2 par les effecteurs positifs des filaments Rad51. Enfin, le Partenaire 1 a développé un système cellulaire permettant d'induire de manière synchrone la formation de filaments Rad51 toxiques, qui sera utilisé pour étudier en profondeur les causes et les conséquences de leur formation. Le projet est organisé en quatre axes de travail (WP): WP1 vise à déterminer la structure de l'interaction Rad52-Rad51 et son rôle dans la formation et la stabilisation du filament Rad51. Les outils de microscopie nouvellement développés par le Partenaire 3 et les mutants de séparation de fonction identifiés par les Partenaires 1 et 2 seront utilisés pour évaluer quantitativement l'impact de Rad52 sur la nucléation et la stabilité des filaments Rad51. WP2 consiste à poursuivre la détermination de la structure des complexes Rad55-Rad57 et SHU en association avec le filament Rad51 et à comprendre l'implication de ces complexes dans la réparation des DSBs ou des CSBs. WP3 consiste en la détermination des mécanismes d'inhibition de Srs2 par Rad52 et les paralogues de Rad51. WP4 établira la base moléculaire des filaments toxiques Rad51 en utilisant le système génétique construit par le partenaire 1.

L'hétérodimère Ku70-Ku80 (KU) est un facteur central de la voie de réparation NHEJ (Non-homologous end joining). KU reconnaît les extrémités de l'ADN générées lors de cassures double-brin (CDB). Il maintient à proximité les deux extrémités d'ADN de la CDB et recrute les enzymes de la voie NHEJ dont l'ADN ligase. KU a également un rôle central dans d'autres voies de stabilité du génome comme le redémarrage de fourches de réplication bloquées et le maintien des télomères. Les 3 partenaires du consortium RubicKU ont initié des collaborations pour comprendre les base moléculaires et cellulaires des rôles multiples de Ku en utilisant deux organismes modèles complémentaires, les levures S. pombe et S. cerevisae. P1 et P2 ont ainsi montré que Ku se lie à l'hybride ADN:ARN au niveau de la fourche de réplication bloquée et régule le redémarrage de la fourche. P1 et P3 ont caractérisé les rôles protecteurs de Ku aux extrémités des télomères. Dans ce projet, nous caractériserons au niveau atomique les interactions de KU avec les substrats ADN, ARN et ADN:ARN. Nous caractériserons par des analyses structurales et des cribles génétiques des mutants de KU déficients spécifiquement pour la liaison d'un de ces substrats (WP1). Nous déterminerons des complexes multiprotéiques de la voie NHEJ de levure et les comparerons aux assemblages humains (récemment déterminés par P1) (WP2). Nous caractériserons le mécanisme moléculaire de KU au niveau des fourches de réplication et montrerons comment sa liaison aux hybrides ADN:ARN régule la dégradation des brins naissants et ajuste finement la stabilité des fourches (WP3). Nous caractériserons l'interaction inexplorée de Ku avec les hybrides ADN:ARN constitutifs générés par la synthèse d'hybride ADN:ARN aux extrémités des télomères pendant les dernières étapes de la réplication des télomères (WP4). Ce projet bénéficiera d'une forte synergie entre les approches en biologie structurale, biochimie et génétique maitrisées par les 3 partenaires.

La recombinaison homologue (RH) est un mécanisme largement conservé qui joue un rôle central dans la stabilité du génome, la fertilité et la diversité génétique. Dans les cellules à cycle mitotique, la RH répare fidèlement l’ADN endommagé en utilisant la séquence d’ADN de la chromatide sœur. Une RH défectueuse conduit à une instabilité génétique ou à la mort cellulaire. Dans les cellules méiotiques, la RH débute par la formation de cassures double-brin programmées. Elle favorise la recombinaison entre les chromosomes parentaux afin de générer des crossing-overs (CO), importants pour la ségrégation correcte des chromosomes homologues. Des défaillances ou erreurs pendant la RH méiotique sont associées à une infertilité ou à des maladies aneuploïdiques telles que le syndrome de Down chez l'homme. La RH méiotique peut être définie comme une "spécialisation" de la RH, car ses principales étapes ressemblent à celles de la RH mitotique, mais elle nécessite des protéines additionnelles, spécifiques de la méiose. Au cours de la dernière décennie, plusieurs de ces protéines ont été identifiées : MEIOB, SPATA22, HSF2BP/MEILB2 et BRME1. L'objectif de ce projet est de tirer parti de l'expertise complémentaire des trois équipes partenaires, en combinant des approches in vivo (modèle de souris), ex vivo (cultures d'organes), biochimiques, biophysiques et de biologie structurale pour décrire les événements qui contrôlent les premières étapes de la RH méiotique. Ainsi, nous déchiffrerons les rôles de MEIOB, SPATA22, HSF2BP/MEILB2 et BRME1 en étudiant leurs interactions, leur recrutement séquentiel et leurs fonctions en collaboration avec les facteurs canoniques de la RH tels que RPA, RAD51 et BRCA2 et la recombinase DMC1 spécifique de la méiose. Nous explorerons également comment un défaut dans la fonction de ces protéines affecte la RH méiotique ainsi que l'intégrité du génome et/ou la fertilité. Notre projet est organisé en 4 tâches. La tâche 1 visera à étudier l'interaction de SPATA22 avec HSF2BP-BRME1. Nous identifierons les interfaces entre ces protéines in vitro (P3) et observerons l'impact de cette interaction sur la structure du filament RPA-MEIOB-SPATA22-ssDNA par microscopie électronique à transmission (TEM) (P2). Nous caractériserons un mutant de souris Spata22 dépourvu du site d'interaction prédit pour HSF2BP (P1&P3). Dans la tâche 2, nous analyserons in vitro comment les protéines de liaison à l'ADN RPA, MEIOB, SPATA22, la protéine médiatrice BRCA2 et les recombinases RAD51 et DMC1 collaborent lors de l'assemblage du filament présynaptique (P2 & P3). Ensuite, nous questionnerons le rôle de HSF2BP et BRME1 dans la régulation de cet assemblage in vitro (P2 & P3). La tâche 3 portera sur l'impact des complexes MEIOB-SPATA22 et HSF2BP-BRME1 sur les produits de recombinaison. Nous utiliserons des approches de microscopie électronique pour tester leur rôle sur la formation, l'architecture et la stabilisation de la D-loop in vitro (P2&P3). P1&P2 développerons une nouvelle approche permettant de visualiser les intermédiaires de recombinaison (immunoprécipitation d'intermédiaires de recombinaison dans des testicules en cultures). Enfin dans la tâche 4, nous suivrons in vivo par immunomarquage la localisation des protéines impliquées dans l'assemblage du filament synaptique afin de déterminer si les complexes proposés par nos approches in vitro sont en accord avec leur localisation in vivo (P1). Notre projet est opportun et innovant car il propose d'utiliser des techniques de pointe, mais aussi de développer de nouveaux outils, afin de comprendre le rôle de nouvelles protéines spécifiques de la méiose dans la formation du filament recombinogène, la capture de la séquence homologue et la stabilisation de la D-loop. Il aura un impact sur la santé publique en contribuant à prédire les défauts de fertilité et, plus généralement, à identifier les mutations génétiques impliquées dans l'instabilité du génome et les maladies héréditaires.

Les télomères protègent les extrémités natives des chromosomes en les empêchant d'être reconnues et traitées comme des extrémités issues de cassures chromosomiques. Cette fonction essentielle des télomères est une pierre angulaire de la stabilité des chromosomes. L'incapacité à protéger les télomères entraîne des fusions chromosomiques dont l'instabilité mitotique conduit à des processus mutationnels catastrophiques. La rareté de ces événements repose sur une protection efficace des télomères établie par un ensemble limité de protéines présentes aux télomères. La protection complète des télomères est le résultat d'une synergie entre plusieurs mécanismes co-existants qui se s’assurent mutuellement. Malgré deux décennies d'études, les mécanismes moléculaires établis par les facteurs télomériques sont encore mal compris aujourd'hui. Pour aborder cette question, nous nous étudions les mécanismes moléculaires individuels de la protection des télomères en utilisant deux systèmes modèles complémentaires: (i) la levure Saccharomyces cerevisiae pour résoudre l’ensemble des voies de protection des télomères contre les fusions et (ii) la levure Schizosaccharomyces pombe pour explorer les points communs entre les espèces et pour ses caractéristiques partagées avec les télomères humains. Nous y parviendrons (i) en disséquant chaque voie isolément des autres et (ii) en combinant un large ensemble d'approches complémentaires in vivo et in vitro.

L'arrêt méiotique homogène est une pathologie rare qui empêche la formation des spermatozoïdes ou cause un arrêt ovarien prématuré, à l’origine d’une infertilité pour laquelle il n’existe aucun traitement aujourd’hui. Des résultats récents confirment une hétérogénéité génétique, mais il n’existe aujourd’hui aucune uniformisation de la description du phénotype testiculaire, ni de validation fonctionnelle des variants génétiques identifiés chez la femme et l’homme. L’objectif du projet MEIOBLOC, suite à l’établissement d’une filière nationale, est de permettre de mieux définir les arrêts de la spermatogenèse et de confirmer l’impact fonctionnel des variants identifiés par le développement de modèles murins et cellulaires. Enfin, plusieurs approches de thérapie génique visant à rétablir la spermatogenèse dans des modèles murins d’arrêt méiotique seront envisagées afin d’évaluer la faisabilité et la sécurité de cette approche en vue d’une éventuelle application clinique.

Chez les mammifères, cellules germinales (CG) et acide rétinoïque (ATRA) sont les clés du succès de la reproduction sexuée. L’ATRA, requis à une étape cruciale de la différenciation des CG mâles, a longtemps été cité à tort comme l’inducteur de l’entrée en méiose dans l’ovaire. Les travaux récents des 4 équipes partenaires du projet ARDIGERM ont brisé ce dogme, tout en révélant des rôles fondamentaux de l’ATRA d’une part dans la prolifération des CG fœtales, qui conditionne la réserve de follicules ovariens, et d’autre part dans l’achèvement du processus méiotique dont dépend la production de gamètes haploïdes génétiquement équilibrés. Ils mettent par ailleurs en exergue l’existence d’un facteur testiculaire inhibant l’entrée en méiose, dépendant de CYP26B1 mais différent de l’ATRA. Le projet ARDIGERM a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces nouvelles fonctions de l’ATRA et d’identifier le facteur inhibiteur de la méiose chez 3 espèces, dont l’Homme.