Physiologie et pathologie moléculaires des rétrovirus endogènes et infectieux

La virothérapie antitumorale représente une alternative prometteuse aux traitements anticancéreux conventionnels. Les virus oncolytiques (OV) infectent plus efficacement les cellules tumorales que les cellules saines, conduisant à la destruction tumorale, via une lyse directe et/ou l'induction d'une réponse immune anti-tumorale. Les travaux de notre laboratoire ont contribué à la découverte de gènes d'enveloppe d'origine rétrovirale, qui se lient à des récepteurs membranaires dont l'expression est augmentée dans une série de cancers. Des virus oncolytiques replicatifs reciblés vers les cellules tumorales ont été mis au point (rOV). Ils ont démontré un ciblage spécifique des tumeurs issues de plusieurs types de cancer ainsi qu'une cytotoxicité ex vivo dans des modèles tumoraux humains 2D et 3D. L’efficacité thérapeutique de ces virus est en cours d’évaluation dans des PDX (Patient-Derived Xenografts) greffées à des souris immunodéficientes. Le projet que nous présentons ici, en partenariat avec la start-up Viroxis qui possède une solide expérience dans le développement de virothérapies vaccinales chez l'animal, consiste à i) évaluer les rOV dans des modèles précliniques tumoraux établis chez des souris immunocompétentes , ii) étudier la tolérance et l'efficacité des rOV chez des patients canins développant des tumeurs spontanées, et iii) valider sur un panel de tumeurs canines et humaines, l'utilisation de biomarqueurs prédictifs de la réponse aux traitements. La réponse attendue devrait permettre de soutenir l'approbation et le lancement d'essai cliniques plus avancés visant à évaluer les rOV en tant que nouvelle thérapie pour le traitement du cancer humain et animal.

Les éléments d'origine rétrovirale, ou HERVs (human endogenous retroviruses), représentent une proportion importante du génome humain. Globalement réprimés en raison de leur origine infectieuse, ils peuvent s’exprimer dans des contextes normaux, notamment la placentation, et/ou pathologiques. Dans les cancers, l'hétérogénéité épigénétique peut entraîner l'activation d'un ensemble de HERVs, qui peuvent à leur tour être associés à l'expression aberrante d'oncogènes via l'utilisation de leurs régions promotrices (LTR, long terminal repeats). Bien qu’issues d'infections intégratives survenues il y a des dizaines de millions d'années, certains gènes de HERV codent encore pour des protéines d'enveloppe fonctionnelles, dont la capacité à se lier à un récepteur endogène -voire de réaliser une fusion cellulaire- a été maintenue. Au cours de nos travaux portant sur les protéines d’enveloppe des HERVs, nous avons identifié plusieurs récepteurs et obtenus des anticorps spécifiques. Ces ligands sont utilisés pour développer de nouveaux outils thérapeutiques qui ciblent les protéines d’enveloppe de HERVs tumeur-spécifiques, HERV-K et HEMO. Des pseudotypes ont été « re-ciblés » grâce à l’expression de 2 protéines de la rougeole, la protéine F sauvage et la protéine H fusionnée à des ligands de HERVs. En partenariat avec VIROxIS, nous proposons de produire des lots précliniques de virus oncolytiques de type virus de la rougeole ou virus de la stomatite vésiculaire (VSV) re-ciblés contre les HERV-K et HEMO et d'évaluer leur activité contre des tumeurs humaines issues de cancers digestifs, gynécologiques et pulmonaires greffables chez la souris (PDX, patient derived xenograft). Le re-ciblage des virus oncolytiques a pour objectif de réduire les risques d'infection/élimination des cellules non cancéreuses. En outre, l’efficacité des virus oncolytiques re-ciblés pourra être accrue grâce à des approches bispécifiques, combinant un récepteur et un anticorps liant l'enveloppe de l’HERV ciblé. Au cours de nos études, nous avons obtenu l’infection de près de 50 % des cellules positives pour l’enveloppe de HERV-K grâce à des pseudotypes exprimant la protéine H fusionnée au récepteur de HERV-K et des pourcentages moindres pour des pseudotypes H fusionnée avec les scfv anti-HERV-K ou anti-HEMO. C’est pourquoi, ce programme de recherche débutera par la préparation de lots pré-cliniques de virus oncolytiques H fusionnée au récepteur de HERV-K, tandis que de nouveaux anticorps anti-HERV-K et anti-HEMO seront sélectionnés à partir de banques d’anticorps humanisés. Nous disposons actuellement de plus de dix anticorps contre les deux protéines d'enveloppe ciblée dans ce programme et un nouveau criblage de banques d'anticorps a d’ores et déjà débuté en collaboration avec l'institut Curie. La validation des anticorps anti-HERVs sera réalisée à la suite de leur évaluation dans des souris PDX sous le format anticorps drogue-conjugué (ADC). Les anticorps présentant la meilleure activité anti-tumorale seront fusionnés à la protéine H pour être appliqués aux virus oncolytiques. En parallèle, leur activité anti-tumorale sera également évaluée sous la forme de lymphocytes T « chimeric antigen receptor » (CAR). Ce programme de recherche vise la mise au point de nouvelles thérapies contre le cancer basées sur l’utilisation des récepteurs de HERVs et d’anticorps spécifiques, en particulier des virus oncolytiques re-ciblés mono ou bispécifiques jamais développés jusqu’à présent, qui en raison de leur caractère réplicatif pourraient éliminer efficacement les tumeurs solides.

La médecine régénérative arrive à maturité et les études précliniques mènent actuellement dans le monde entier, y compris en France, à des essais cliniques dans une diversité d’applications de thérapies cellulaires/tissulaires substitutives. Néanmoins, un obstacle majeur entrave les progrès vers l’expansion de cette nouvelle forme de médecine à tous les patients qui en ont besoin : le rejet immunitaire des greffes de cellules allogéniques. L’utilisation massive de médicaments immunosuppresseurs est clairement interdite, en ce moment, en raison de son risque tumorigène élevé. L’ambition globale du programme Ghosting the Cells (GTC) est de combler cette lacune en concevant une façon originale de procéder à la transplantation de cellules rendues invisibles au système immunitaire du receveur. Nous proposons de le faire par le biais de cellules génétiquement modifiées pour exprimert le peptide immunosuppresseur (ISD) qui permet aux rétrovirus d’échapperà la surveillance immunitaire. Le programme est fondésur deux lignées iPS conçues déjà produites et contrôlées pour leur capacité à se différencier en trois phénotypes cellulaires d’intérêt, à savoir les kératinocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales. Ces cellules, associées à un biomatériau de fibrine dans lequel les deux dernières populations cellulaires sont incrustées, et la première ensemencée à la surface, forment ensemble un substitut dermo-épidermique. Sur la voie de cet objectif global, nous avons identifié quatre étapes intermédiaires. 1. L'identification de biomarqueurs d'efficacité des ISD dans les cellules immunitaires, nécessaire pour suivre les réponses à la greffe de nos cellules. 2. La caractérisation de l'effet protecteur de l'ISD en fonction du statut immunitaire des cellules transplantées, car les cellules endothéliales expriment HLA I et II, tandis que les kératinocytes et les fibroblastes expriment uniquement HLA I, et ce dernier est connu pour susciter une certaine forme de tolérance. 3. L'identification d'un moyen efficace d'éliminer un produit immuno-invisible comprenant des cellules aux capacités prolifératives différentes (kératinocytes>fibroblastes>cellules endothéliales). Un tel "interrupteur de sécurité" est un complément obligatoire au cas où l'on serait confronté à un effet indésirable des cellules transplantées invisibles aux défenses immunitaires normales. 4. Et, enfin, la démonstration finale de l'efficacité et de la sécurité du substitut dermo-épidermique constitué en tissu compact et organisé autour d'un biomatériau. Notre consortium apportera collectivement son expertise dans tous les domaines couverts: 1. Analyses moléculaires et cellulaires des populations de lymphocytes T et NK en présence des cellules exprimant ISD (CNRS 9196, Viroxis); 2. Tests immunologiques in vitro et in vivo d'allo-identification et de tolérance (Viroxis, CRTI INSERM 1064); 3. Production de populations cellulaires homogènes (kératinocytes, fibroblastes, cellules endothéliales) à partir de lignées iPS humaines (CECS / I-Stem); 4. Production de greffons dermo-épidermiques composites à partir de ces cellules différenciées (CECS/I-Stem); 5. Souris immunodéficientes et secondairement humanisées par PBMC (CRTI INSERM 1064); 6. Modèle de greffe de tissu dermo-épidermique humain chez la souris (CRTI INSERM 1064, CECS/I-Stem). Le succès du programme GTC lèvera un verrou important dans le domaine de la médecine régénérative tout en conduisant, dans le même temps, à des brevets solides et à des publications de rupture. L'intérêt des entités commerciales et / ou des fonds de capital-risque attirés par l'application et l'exploitation de la médecine régénérative issue de l'iPS est anticipé et sera exploité par le biais d'accords de licence. En fin de compte, des stratégies efficaces qui s'attaquent aux barrières immunologiques mèneront à de nouvelles formes de thérapie et devraient réduire les temps d'attente et les coûts encourus par les services de santé.

Les échecs répétés des essais cliniques des précédents candidats vaccins contre le virus HIV-1 au même titre que l’effet modéré de l’essai vaccinal RV144 ont souligné la nécessité de nouveaux vecteurs vaccinaux avec des nouvelles fonctions immunes ainsi que des stratégies « prime-boosts » combinant des vaccins pré-existants. Une stratégie basée sur l’utilisation du vecteur viral de la rougeole combiné à des boost-protéiques pourrait remplir ces conditions. En effet, nous avons démontré dans une étude initiale qu’un vecteur rougeole exprimant Gag, Env et Nef (measles virus-simian-human immunodeficiency virus, MV-SHIV) induisait le contrôle de la virémie du SHIV162p3. Ce contrôle se traduisait par la réduction de la virémie au pic de près de deux logs, ainsi que par une forte diminution de la charge virale en une semaine (p=0.0001, Wilcoxon test). De plus, les singes vaccinés maintiennent leurs taux de lymphocytes à un niveau > 1000 cellules/µl à la suite des challenges (contrairement aux singes placebos tous en dessous de ce seuil). Ce contrôle de la virémie plasmatique se traduit par une réduction marquée de la taille des réservoirs dans les PBMCs, la rate, les ganglions lymphatiques axillaires et inguinaux et le rectum (comme démontré par un niveau de provirus intégré = 10 copies d’ADN par millions de cellules). De façon intéressante, le contrôle du virus de challenge est corrélé avec la réponse immune cellulaire anti-Gag. Cependant, le vaccin MV-SHIV seul n’est pas capable de retarder l’acquisition du SHIVSF162p3 après des challenges intra-rectaux répétés, ce qui est crucial pour un vaccin contre un virus intégratif comme le HIV. Cela pourrait être dû à l’absence d’anticorps plasmatiques neutralisants de type IgG (contre le SHIVSF162p3 tier-2) et d’IgA mucosaux (au niveau des secrétions rectales) connus pour être associés à une protection complète à l’infection, ou minimalement a un retard d’acquisition du virus. C’est pourquoi, nous proposons dans cette étude de combiner le vaccin MV-SHIV avec des boosts protéiques constitués de la région externe de la sous-unité gp41 de la protéine d’enveloppe de HIV. Ce polypeptide gp41 comprendra 3 domaines fonctionnels très conservés : le domaine immunosuppresseur (ISD) (qui est la cible d’anticorps de type IgA retrouvés dans les personnes « Exposées Non-infectées », EN), le motif « 3S » (qui induit des anticorps inhibiteurs de la lyse cellulaire NK-dépendante) et la région MPER (membrane-proximal external region, reconnue par des anticorps retrouvés chez les patients « EN » et qui possèdent une activité de neutralisation et de blocage de la transcytose virale). Des polypeptides gp41 synthétisés chimiquement en présence ou non de nanoparticules de type PGLA et/ou d’adjuvants (agonistes de TLR4 et TLR7/8) et/ou d’un vecteur MV exprimant la gp41 seront évalués dans un premier temps chez la souris afin de choisir la meilleure stratégie vaccinale (à même d’induire un niveau haut et soutenu d’anticorps circulants et mucosaux anti-gp41). Par la suite, des macaques cynomolgus seront vaccinés avec le vecteur MV-SHIV et boostés par la formulation définie chez la souris, puis challengés intra-vaginalement par le virus SHIVSF162p3. Notre objectif est de produire la preuve de concept de l’efficacité de ce nouveau vaccin/combinaison vaccinale dans la perspective d’un essai clinique de phase I chez l’Homme. A terme ce projet vise à évaluer chez des patients ce candidat vaccin dans des approches prophylactique et thérapeutique.