Chimie et Modélisation pour la Biologie du Cancer, UMR9187-U1196

Le projet NeOClick vise à développer de nouvelles réactions organocatalysées de cycloadditions s'appuyant sur des stratégies employant la fluorescence. Ceci permettra de tester un grand nombre de catalyseurs et de conditions via un criblage à haut débit. Les partenaires impliquées dans les réactions OrganoClick sont des cétones activées qui seront transitoirement transformées en énamines afin de réagir avec des dipôles ou des diènes. Le projet s'articule en 3 tâches distinctes: 1) La mise au point de réactions OrganoClick en employant soit une stratégie s'appuyant sur la fluorogénécité soit une stratégie s'appuyant sur des phénomènes de FRET, 2) la mise au point de réaction Click & Release en s'appuyant sur la fluorogénécité de cycloadditions dans une perspective de bioorthogonalité, 3) la mise au point de versions énantiosélectives de réactions OrganoClick. Dans chacune de ces tâches, les phénomènes associés à la fluorescence permettront de cribler un grand nombre de paramètres réactionnels.

La combinaison des techniques d’imagerie optique associée à la chirurgie est une voie prometteuse car elle permet de guider le geste du chirurgien. La chirurgie guidée par fluorescence (FGS) offre ainsi une vision plus précise de la cible. Cette approche passe par l’élaboration d’outils spécifiques. Dans ce contexte, nous nous proposons de développer des sondes fluorogéniques à absorption mono- et bi-photonique (1PA et 2PA). Ainsi, l’utilisation de sondes émettant dans le proche infra-rouge (NIR) et/ou excitables à deux photons nous permettra de concevoir des outils d’imagerie utilisables in vivo en s’affranchissant des problèmes d’autofluorescence et de photodommage. L’utilisation de sondes 2PA activables représente le cœur du projet I-SEE-U en proposant des outils innovant répondant aux besoins d’une FGS toujours plus précise. Ainsi, ces sondes seront pensées pour répondre à un stimulus biologique marqueur d’une pathologie. Les sondes développées seront ainsi sensibles à une surexpression d’enzymes. Ces sondes seront modifiées structurellement afin de les fusionner à des systèmes permettant d’apporter le caractère OFF-ON de ces sondes et/ou modifiant leurs propriétés physico-chimiques. Le projet I-SEE-U sera mené en 4 étapes interconnectées. Tout d’abord, une part importante de ce projet sera consacré à une méthodologie de synthèse organique sera réalisée pour donner une librairie de molécules basée sur une stratégie de rigidification prometteuse (WP1) qui fera l’objet d’une étude photophysique systématique (WP2) nous permettant d’optimiser la relation structures/propriétés photophysique. Enfin une fois, les candidats les plus prometteurs sélectionnés, ces derniers feront l’objet d’études in cellulo et in vivo poussées. Ainsi, à travers ces 4 étapes le but du projet I-SEE-U est de développer des sondes fluorogéniques performantes en accord avec les technologies actuelles (1PA) et futur (2PA) utilisé pour la FGS.

Les structures alternatives d’acides nucléiques recouvrent l’ensemble des structures de l’ADN qui diffèrent de la double hélice dite de Watson & Crick (ou duplexe). Ces structures sont actuellement au cœur d’un intense effort de recherche qui vise à comprendre où, quand et comment elles se forment au sein de nos cellules. Du fait des rôles de plus en plus importants qui leur sont attribués dans des systèmes de régulation génomique complexes, ces structures deviennent des enjeux majeurs pour la génétique et des cibles privilégiées pour des approches chimiothérapeutiques innovantes. Dans ce contexte, les quadruples hélices d’ADN (ou quadruplexes) occupent une place centrale depuis plus de 20 ans. Dans un contraste saisissant, l’étude des jonctions d’ADN, notamment celles à trois voies (ou TWJs pour Three-Way DNA Junctions), n’est qu’émergente. Pourtant, l’implication de ces structures dans des maladies génétiques dites ‘à séquences répétées’ (ou REDs pour Repeat Expansion Diseases), telles que les maladies d’Huntington et de Steinert, n’est plus à démontrer. Malgré cela, à ce jour, aucun effort n’a été produit pour étudier l’existence et la dynamique des TWJs dans notre génome, à l’exception notable d’une étude publiée très récemment (2021) par le consortium du présent projet. Ainsi, nous nous proposons ici de poursuivre ce premier effort de recherche et de déployer l’ensemble des outils de chémobiologie les plus récents et performants pour décrypter la biologie cellulaire des TWJs et sonder leur réel potentiel thérapeutique. Notre effort sera résolument multidisciplinaire (chimie organique et théorique, biophysique et biochimie, biologie moléculaire et structurale ; disciplines personnalisées par les différents partenaires de ce projet), applicatif et translationnel, car nous nous emploierons à rendre accessibles à tous non seulement les outils moléculaires mais aussi l’ensemble des techniques et protocoles qui seront développés dans le cadre de ce projet.

Les structures secondaires non canoniques d'acides nucléiques ont émergé au cours des dernières décennies comme des facteurs critiques modulant le métabolisme de l'ADN et de l'ARN. Les i-motifs (ADN-i), qui correspondent à des structures d'ADN non usuelles à quatre brins dans lesquelles les cytosines sont intercalées via un empilement de paires de bases C–C hémi-protonées, peuvent se former au niveau des séquences génomiques C-riches des promoteurs ou des télomères. Certaines de ces structures ADN-i ont été bien caractérisées in vitro, mais les données sur leur pertinence biologique sont encore limitées, en raison d’un a priori sur leur formation à bas pH. D’autres structures à quatre brins G-riches (G-quadruplexes, G4) pourraient se former en vis-à-vis de l'ADN-i, mais leur coexistence aux mêmes sites est encore incertaine et à déterminer. Les règles régissant la formation d'ADN-i sont peu précises, quelques ADN-i peuvent être formés à pH neutre, indiquant que les algorithmes de formation des G4 ne peuvent pas être directement transposés pour prédire la formation d'ADN-i. Récemment, le marquage par un anticorps spécifique (iMab) et la RMN in cellulo ont démontré que les structures ADN-i peuvent se former et sont stables dans les noyaux des cellules humaines. Contrairement aux G4 dont la pertinence biologique a été démontrée par des anticorps et des outils chimiques très spécifiques, peu de molécules sont connues pour interagir avec l'ADN-i et une controverse sur leur mode de fixation, leur sélectivité et leur affinité persiste dans la littérature. La dynamique des ADN-i (c'est-à-dire leur capacité à se replier ou à se déplier) peut être essentielle pour moduler des processus biologiques clés. La découverte de l'iMab a permis de prouver qu'un ciblage sélectif de ces structures est possible. Il a été démontré qu'un certain nombre de protéines interagissaient avec les G4, mais peu de protéines interagissant avec l'ADN-i ont été décrites à ce jour. De plus, il n'est pas clair si ces protéines reconnaissent les structures ADN-i, les séquences riches en cytosine ou les nucléotides dans les boucles d’ADN-i. Dans ce contexte, le projet iCARE s'appuie sur une expertise pluridisciplinaire associant des chimistes, des biophysiciens, des biochimistes et des biologistes, qui ont déjà fait leurs preuves pour travailler avec succès ensemble (voir les publications conjointes de ses membres). iCARE vise à atteindre les objectifs scientifiques suivants: -Comprendre les règles qui régissent la formation des ADN-i, leur dépendance au pH, leur thermodynamique, leur cinétique de repliement, et leur pertinence biologique par rapport aux G4 (WP1); -Identifier de vrais ligands interagissant avec l'ADN-i (c'est-à-dire affins et spécifiques) en utilisant une nouvelle stratégie pour verrouiller l'ADN-i dans un état replié stable à pH physiologique, afin d’étudier leurs effets cellulaires comme sondes chimiques d’ADN-i ou comme candidats thérapeutiques (WP 2); -Identifier les protéines interagissant avec l'ADN-i (en utilisant une stratégie originale couplée à une analyse protéomique) et déterminer leur intérêt biologique sur les sites génomiques potentiels d'ADN-i (WP3). En effet, l'utilisation d'ADN-i contraint comme substrat pH-indépendant (WP2 & WP3) représente l’élément clé de ce projet par rapport aux approches précédemment utilisées, permettant de surmonter les limitations actuelles pour cribler des ligands spécifiques à pH neutre et pour identifier l'interactome ADN-i-protéine. La réalisation de ce projet améliorera la compréhension des fonctions biologiques de l’ADN-i au niveau du génome et comme cible cellulaire. En effet, les molécules ciblant directement l'ADN-i ou interférant avec sa dynamique de formation ont un intérêt thérapeutique. Enfin, l'acquisition de données in vitro combinée à celles de l'interactome des ADN-i, permettra améliorer leur prédiction génomique chez l'homme et aussi pour d’autres applications dans d'autres organismes