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Les centres fer-soufre (Fe-S) sont des groupes prosthétiques de protéines essentiels. Les défauts de synthèse des centres Fe-S conduisent à des maladies humaines graves telles que l'ataxie de Friedreich (FA), une maladie cardiaque et neurodégénérative due à un défaut d'expression de la frataxine. Bien que la thérapie génique apporte aujourd’hui des résultats prometteurs, la nécessité de délivrer ces médicaments de manière locale au site affecté (cervelet et coeur) reste un défi pour le développement de ce type de thérapie. Plusieurs médicaments visant à restaurer le taux de frataxine et à mimer sa fonction sont actuellement en test clinique, mais les résultats ne sont pas concluants. La raison principale est que la fonction moléculaire de la frataxine reste inconnue. Un rôle de chaperonne à fer a été proposé mais ce modèle est aujourd’hui controversé. Nos études suggèrent plutôt que la frataxine est impliquée dans la mobilisation du soufre pour la protéine d'échafaudage ISCU, sur laquelle sont assemblés les centres Fe-S. Cependant, les mécanismes d'assemblage des centres Fe-S restent très mal compris, ce qui est obstacle pour clairement définir la fonction moléculaire de la frataxine et par conséquent pour le développement de nouvelles thérapies destinées à substituer la frataxine. Pour commencer à répondre à ces questions, nous avons reconstitué la machinerie mitochondriale d'assemblage des centres Fe-S. Nous sommes parvenu à caractériser pour la première fois, une forme d’ISCU contenant du fer et compétente pour l'assemblage des centres Fe-S dans des conditions physiologiquement pertinentes. A l’aide de ce système nous avons entrepris une étude étape par étape. Nos données préliminaires indiquent que la frataxine n'est pas nécessaire pour l'insertion du fer, mais qu'elle intervient dans une étape ultérieure. Le processus d’assemblage semble être initié par la synchronisation de l'apport de fer et de soufre à ISCU. Cette étape repose sur une réaction inédite de transfert de persulfure assistée par le fer d’ISCU, entre la désulfurase de cystéine NFS1 et ISCU. Dans une seconde étape, le persulfure transféré à ISCU est réduit par la ferredoxine FDX2 en ion sulfure. Cette réaction semble également être assistée par le fer, ce qui permettrait in fine l’association du fer et de l’ion sulfure généré afin d’éviter sa diffusion en dehors du complexe. De manière importante, nos données indiquent que la frataxine stimule l'assemblage de centre Fe-S en augmentant la vitesse de la réaction de transfert de persulfure assistée par le fer, potentiellement en modulant la structure du centre fer. Ces données semblent donc indiquer un changement de paradigme pour la fonction moléculaire de la frataxine et donner une description rationnelle du processus d’assemblage. L'objectif de ce projet est d'étudier de manière détaillée le mécanisme d'assemblage des centres Fe-S ainsi que l'effet de la frataxine sur cette réaction en utilisant des méthodes biochimiques, spectroscopiques et structurales, combinées à des approches cellulaires pour i) valider la pertinence physiologique de notre machinerie reconstituée, ii) clairement élucider le rôle de la frataxine dans ce processus et iii) proposer une base structurale pour cette réaction à l'échelle atomique. Les principaux résultats attendus pour ce projet sont: 1) démontrer comment la frataxine stimule l'assemblage de centre Fe-S pour mieux définir la physiopathologie de FA, 2) mettre en place un test pertinent d'un point de vue physiologique pour le criblage à grande échelle de médicaments mimant la frataxine, 3) proposer une base structurale pour l'effet de la frataxine afin de permettre la conception de composés mimant la frataxine et 4) proposer une description claire du processus d'assemblage des centres Fe-S dans la mitochondrie comme base pour élucider l’ensemble des processus de biogenèse des centres Fe-S dans mitochondrie et dans le cytoplasme.

Les rétroéléments se répliquent par transcription inverse de leur génome ARN en un ADN complémentaire qui est intégré de manière stable dans le génome de la cellule hôte par leur intégrase (IN). L'intégration n’est pas aléatoire in vivo. La spécificité d’intégration des rétroéléments dépend principalement de l'interaction de l’IN avec des facteurs cellulaires qui vont diriger l’insertion virale vers des régions préférentielles. Cependant, les bases moléculaires régissant le choix du site d’intégration restent encore mal comprises. L’étude des rétrotransposons Ty1 et Ty3 de levure a contribué à une meilleure connaissance de la biologie des rétroéléments. Ils s’intègrent au niveau des gènes transcrits par l’ARN Polymérase III (Pol III), qui sont des régions pauvres en gènes. Cette remarquable sélectivité du site d'intégration a été étudiée in vivo et in vitro; Toutefois, il n'existe aucune information structurale sur le processus d'intégration ou d'interaction avec la Pol III. Ce projet vise à comprendre comment les interactions entre les intégrases de Ty1 et Ty3 et les différents constituants de la machinerie de transcription par la Pol III contribuent à l’intégration ciblée. Notre stratégie sera d'obtenir et de caractériser les structures des intégrases de Ty1 et Ty3, et également celles des complexes obtenus avec leurs partenaires de la machinerie Pol III, afin de disséquer les mécanismes moléculaires impliqués dans ces interactions. Nous suivrons le programme suivant : 1) exprimer et analyser les propriétés biophysiques des complexes IN-Pol III - produire des protéines actives homogènes impliquées dans le processus d'intégration; - utiliser des techniques biochimiques et biophysiques pour caractériser l'interaction des INs avec l’ADN viral et leurs partenaires Pol III respectifs, et définir les conditions optimales pour assembler et purifier des complexes stables. 2) caractériser au niveau atomique le mécanisme d'intégration de Ty1 et Ty3 et les interactions avec la machinerie Pol III - cristalliser et caractériser la structure des protéines IN apo et complexées avec l'ADN. Notre objectif est d'isoler, stabiliser et déterminer la structure des intermédiaires d'intégration pour définir le mécanisme d'intégration; - analyser les complexes IN-Pol III par cryo-EM et les comparer aux modèles atomiques de Pol III libre ou à la structure cristallographique de TFIIIB. 3) construire des IN rétrovirales chimères dotées de la spécificité d’intégration de Ty1 - identifier les acides aminés responsables de l'interaction directe entre l’IN de Ty1 et Pol III; - analyser in vivo l'impact des mutations qui abolissent ces interactions sur l'intégration ciblée de Ty1; - étudier si l'interaction Ty1 IN-Pol III est régulée par des modifications post-traductionnelles; - concevoir des IN rétrovirales chimériques dotées des préférences d'intégration de Ty1 qui pourraient être utilisées dans des vecteurs de transfert de gènes. Plusieurs résultats sont attendus : - la première caractérisation structurale de l'interaction entre un complexe multi-protéique et une intégrase de rétroélement, qui devrait permettre d’expliquer comment les interactions IN/Pol III contribuent à la sélection du site d'intégration ; - une meilleure compréhension des mécanismes régulant la spécificité d'intégration des rétrovirus. Ces résultats auront un impact important sur la santé humaine en fournissant des outils précieux pour la conception de nouvelles molécules modulant l'intégration rétrovirale. - la possibilité de modifier les préférences d'intégration d'autres rétrovirus. Cette avancée constituerait une contribution majeure au développement d'une nouvelle génération de vecteurs de thérapie génique plus sûrs qui cibleraient préférentiellement des régions non essentielles du génome. Avec ce projet, nous devrions apporter une preuve de concept qu’il est possible de construire de tels vecteurs.

Les récepteurs nicotiniques de l’acétylcholine (nAChR) sont des récepteur-canaux pentamériques qui assurent la communication excitatrice entre neurones. Dans le cerveau, le nAChR majeur est généré par l’association des sous-unités a4 et ß2, et une sous-population mineure contient également la sous-unité a5 (a4ß2a5 nAChRs). Des données génomiques récentes ont démontré un lien entre un polymorphisme très répandu (SNP) de la sous-unité a5 et l’addiction au tabac et au cancer du poumon. Ce polymorphisme génère une perte de fonction des a4ß2a5 nAChRs. Il est donc anticipé qu’une potentiation spécifique de ces récepteurs par un potentiateur allostérique spécifique de la sous-unité a5 (PAMa5) serait un traitement de la dépendance à la nicotine. A ce jour, la sous-unité a5 est “orpheline” sans ligand connu. Pour découvrir de novo un PAMa5, nous proposons de cibler un site de liaison unique à l’interface entre les sous-unité a5 et a4. Ce site a5/a4 est homologue au site qui lie l’ACh à l’interface a4/ß2. Nous développerons une approche rationnelle en utilisant des nAChRs modifiés. Nous avons développé un modèle du site a5/a4 nommé AChBP-5/4. L’AChBP est une protéine homologue au domaine extracellulaire des nAChRs, et nous l’avons muté en 25 positions pour reconstituer un site a5/a4 intégral. L’AChBP-5/4 permet de réaliser des expériences de liaison par résonance plasmonique de surface (SPR) et des structures cristallographiques. Nous avons déjà identifié quelques alcaloïdes se liant sur l’AChBP-5/4. En parallèle, nous avons développé des concatémères pentamériques du a4ß2a5 nAChR qui permettront des expériences d’électrophysiologie précises. A partir de ce corpus d’expériences préliminaires, nous développerons une approche de découverte de ligands basée sur les fragments. Nous générerons une librairie de fragments dérivés d’alcaloïdes, qui seront criblés pour leur liaison à l’AChBP-5/4 par « docking » in silico, liaison par SPR et cristallographie. Ils seront également testés sur les concatémères pour leur pouvoir modulateur par électrophysiologie, et sur des modèles in silico des a4ß2a5 nAChRs qui simulent leur chemin conformationel d’activation. Les fragments identifiés seront reconstruits en molécules plus affines, par les techniques de liaison et de fusion chimique, et également par « click-chemistry » in situ sur l’AChBP-5/4. Ainsi, nous proposons une approche intégrée pour relever le défi de trouver de novo un PAMa5. Le projet est basé sur de données préliminaires importantes, et nous combinerons plusieurs stratégies en parallèle pour augmenter nos chances de succès. Les PAMa5 seront précieux pour étudier la contribution de la sous-unité a5 aux mécanismes moléculaires et allostériques des nAChRs. Ils permettront également d’étudier les nAChRs natifs, par exemple dans les tranches de cerveau ou dans l’animal vivant, pour établir la contribution de la sous-unité a5 aux processus physiopatholoqiques. Plusieurs compagnies pharmaceutiques développent des ligands nicotiniques, et les composés identifiés seront brevetés avant de contacter les industriels, avec une indication bien établie pour le sevrage tabagique. A coté de ces impacts, notre stratégie expérimentale pourra être généralisée aux autres interfaces des nAChRs présents dans le cerveau et à la périphérie, ouvrant la voie au développement de nouvelles classes de composés spécifiques.

A. CONTEXTE Ce projet aborde le stress oxydant et le vieillissement par l’étude des peroxiredoxines (Prx), des peroxydases à cystéine catalytique (CP), impliquées dans la signalisation H2O2. La suroxydation de CP par H2O2 inactive ces fonctions et confère aux Prxs une activité chaperon de type holdase. La sulfiredoxine catalyse la réduction de la CP, régulant ainsi les fonctions des Prx. Nous avons montré récemment qu’une copie supplémentaire du gène TSA1, codant la Prx majeure de S. cerevisiae, accroit la durée de vie réplicative de la levure via une nouvelle voie contrôle de qualité des protéines (PQC) impliquant les chaperons Hsp70. Nous avons aussi montré que l’adaptation de la levure à des concentrations extrêmes d’H2O2 dépendait uniquement de l’activité peroxydase de Tsa1. TSA1 et similairement, les Prx d’autres organismes possèdent des phénotypes très riches, mais, à l’exception des deux exemples ci-dessus, il est généralement impossible de les corréler à une des fonctions moléculaires des Prxs. La relation structure-fonction des Prx est bien décrite pour la fonction peroxydase, mais pas pour la fonction PQC, encore peu définie. B. OBJECTIF GÉNÉRAL Ce projet vise à élucider les mécanismes sous-tendant les fonctions des Prx in vivo et à associer systématiquement activité enzymatique et phénotype durant le stress oxydant et le vieillissement, ce qui implique d’élucider le mécanisme de l’activité PQC. Le projet vise de plus à explorer l’hypothèse d’un rôle des Prx dans les effets protecteurs de H2S vis-à-vis de H2O2. C. STRATÉGIE 1. Générer des mutants séparant de façon non ambiguë les activités peroxydase et chaperons des Prx, aujourd’hui la meilleure stratégie d’étude en raison de l’intrication moléculaire de ces fonctions: - Par ingénierie structure-fonction, - Par sélection de mutants TSA1 générés au hasard dans des conditions dans lesquelles l’une ou l’autre des fonctions de Tsa1 est nécessaire à la viabilité, et grâce à un système microfluidique permettant de suivre l’adaptation au stress H2O2 et le vieillissement réplicatif sur cellule unique de levure. 2. Caractérisation complète des mutants - In vitro par des approches biophysiques et biochimiques - In vivo par des approches de biologie et biochimie cellulaires 3. Explorer les effets de H2S dans le vieillissement et le stress H2O2 et de leur modulation par les Prx, par la mise en place d’une souche de levure surproduisant H2S de façon conditionnelle, et tester l’hypothèse d’un rôle direct des Prx en tant qu’oxydase d’H2S. 4. Corréler systématiquement activités enzymatiques et phénotypes, dans les conditions calibrées (i) utilisées pour le du criblage des mutants, et (ii) dont la dépendance à TSA1 est inconnue et sera ainsi révélée. D. CONSORTIUM Le projet s’appuie sur une forte complémentarité et synergie entre trois équipes ayant collaboré aux données préliminaires du projet et conçu son approche stratégique. M. Toledano (CEA-Saclay, coordinateur), expert en génétique de levure et biochimie du stress oxydant et des protéines redox et G. Charvin (CNRS-IGBMC, Strasbourg), expert en biologie des systèmes, conduiront les essais de tolérance à H2O2 et de vieillissement réplicatif grâce à un système de microfluidique qu’il a inventé ; S. Rahuel-Clermont (CNRS-Nancy), experte en enzymologie moléculaire qui concevra les mutants avec M. Toledano et conduira les analyses in vitro des mutants. E. RÉSULTATS ATTENDUS Le projet contribuera à élucider les relations structure-fonction des Prx, leur rôle physiologique, et réciproquement repousser les limites des connaissances des processus moléculaires responsables du stress oxydant et du vieillissement, afin d’ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques des maladies liées au vieillissement, en particulier neurodégénératives et cancer.

Au début du processus infectieux, les phages déjouent les mécanismes de défense et détournent les fonctions cellulaires de l'hôte à leur profit. Bien que les phages aient été découverts il y a maintenant un siècle, et qu'ils soient à l'origine de nombreuses avancées scientifiques et biotechnologiques, les mécanismes d'infection qu'ils mettent en œuvre au début de leur cycle infectieux sont encore mal compris. Le phage T5 transfère son ADN dans le cytoplasme de la bactérie Escherichia coli en deux étapes. Ce système constitue un modèle privilégié pour étudier le détournement des fonctions cellulaires indépendamment des autres étapes du développement viral. Les gènes de T5 responsables du détournement des fonctions de la bactérie sont exprimés avant le transfert complet du génome viral et l'infection peut être bloquée à ce stade. Cette première étape conduit à la dégradation rapide de l'ADN bactérien et à l'inhibition de l'expression des gènes précoces du phage. Le transfert de l'ADN reprend ensuite et cette deuxième étape permet de compléter le cycle infectieux jusqu'à la production de nouveaux phages. On sait depuis plus de 50 ans que deux protéines codées par le premier fragment d'ADN injecté, A1 et A2, sont essentielles pour le bon déroulement de ces évènements précoces. Cependant leur fonction n'est toujours pas élucidée. Nous avons récemment démontré que A1 est une nucléase et que A2 est un régulateur transcriptionnel. Le projet TakeoverBac propose une étude pluridisciplinaire et intégrative des protéines A1 et A2. Nous voulons explorer leurs propriétés fonctionnelles in vitro et in vivo dans le but de: (1) comprendre comment l'activité nucléase de A1 détruit le génome bactérien et si cette activité est corrélée à la reprise du transfert de l'ADN viral. (2) élucider comment la transcription des gènes du phage et de la bactérie est orchestrée par A2. (3) identifier les protéines partenaires de A1 et A2 qui sont essentielles pour l'infection. Le consortium TakeoverBac qui regroupe des compétences en biologie des phages, génétique bactérienne, biochimie et biologie structurale, conduira une étude moléculaire et cellulaire de la prise de contrôle des bactéries par les phages. L'ensemble de ce projet mettra en évidence des fonctions vitales de la bactérie spécifiquement ciblées par le phage T5. Aujourd'hui, notre société doit faire face à l'augmentation alarmante de bactéries pathogènes multi-résistantes aux antibiotiques et à une lacune dans le développement de nouvelles molécules antibactériennes. Notre étude permettra d'initier de nouveaux axes de recherche, ce qui est essentiel dans ce contexte préoccupant. Les résultats de ce projet ouvriront des perspectives pour le développement d'outils inspirés par les phages, utiles pour la recherche et la lutte contre les infections bactériennes.

Les héparanes sulfate (HS) sont des polysaccharides complexes présents en abondance à la surface des cellules et dans les matrices extracellulaires. Ces polysaccharides sont impliqués dans un très grand nombre de processus cellulaires, de par leur capacité à fixer et moduler l’activité d’un vaste répertoire de protéines. Les interactions HS/ligands impliquent des régions spécialisées (les domaines S) situées au sein de la chaine polysaccharidique, et caractérisées par leur séquence saccharidique et leur profil de sulfatation. L’expression de tels motifs est étroitement contrôlée lors de la biosynthèse des HS, mais également au niveau post-synthétique par l’action d’enzymes extracellulaires telles que les Sulfs. Les Sulfs constituent une famille de sulfatases récemment identifiée, qui ciblent spécifiquement les domaines S des HS et catalysent l’élimination sélective de groupements 6-O-sulfate impliqués dans la reconnaissance de nombreuses protéines. Bien que structuralement limitée, l’action de ces enzymes altère de manière radicale les capacités d’interaction et les propriétés biologiques des HS. De ce fait, Les Sulfs sont impliquées dans de nombreux processus physiopathologiques, tels que le développement embryonnaire, la régénération tissulaire ou le cancer. Deux isoformes de Sulfs ont été identifiées : Sulf-1 et Sulf-2. Ces enzymes présentent une organisation moléculaire commune et sont constituées de 2 domaines essentiels pour leur activité : un domaine catalytique (CAT-D) très conservé parmi les sulfatases et comprenant le site actif de l’enzyme et un domaine hydrophile et hyper-basique (Hyd-D), uniquement retrouvé chez les Sulfs et impliqué dans la reconnaissance des substrats de type HS. Cependant, malgré un intérêt croissant, les Sulfs demeurent encore très mal connues. Nos récents travaux sur ces enzymes ont permis la mise en évidence d’un mécanisme original d’action processive et de caractéristiques structurales remarquables. Sur la base de ces résultats, le projet SULF@AS propose une étude intégrée des 2 isoformes humaines HSulf-1 et HSulf-2, combinant des approches biochimiques et biophysiques en vue de déterminer leur structure et leurs modifications post-traductionnelles, des analyses fonctionnelles in vitro, in cellulo et in vivo afin de définir leurs spécificités de substrat et leurs rôles respectifs au cours de la progression tumorale, et le développement d’inhibiteurs spécifiques basés sur des mimétiques d’HS. Les résultats obtenus devraient fournir des informations précieuses sur cet important mécanisme de régulation de l’activité des HS. Par ailleurs, ils devraient établir les bases structurales pour le développement de nouvelles approches thérapeutiques ciblant les HSulfs.

L’hème, le cofacteur de l’hémoglobine, est une molécule essentielle mais toxique pour tous les organismes. Alors que de nombreux pathogènes à Gram positif sont confrontés à la toxicité de l’hème du sang lors du processus infectieux, ceux-ci répondent par l’expression d’un transporteur d’efflux de l’hème, HrtBA. Cette pompe membranaire leur permet de réguler l’accumulation d’hème intracellulaire et donc de limiter sa toxicité. L’expression de HrtBA est induite par l’hème exogène via l’activation d’un système à deux composants (TCS, two-component system) appelé HssRS (Heme sensing system). HssRS est constitué d’un senseur membranaire, HssS et d’un régulateur transcriptionnel de hrtBA, HssR. L’action conjuguée de ces deux protéines permet la détection de l’hème exogène et l’activation de la réponse transcriptionnelle qui aboutit à la biosynthèse de HrtBA. Des pathogènes à Gram positif qui ne peuvent expulser l’excès d’hème (DhrtBA) ont une virulence atténuée car leur capacité à s’adapter au stress hème dans l’environnement de leur hôte est limitée. L’hypothèse de travail du projet « HemeDetox » propose donc de considérer que l’inhibition du mécanisme de détection de l’hème par HssS permettrait de bloquer l’expression de HrtBA limitant ainsi la virulence de pathogènes cibles. Deux pathogènes à Gram positif majeurs, Staphylococcus aureus et Streptococcus agalactiae (aussi appelé GBS pour Group B Streptococcus) utilisent le transporteur d’efflux HrtBA pour assurer l’homéostasie de l’hème. L’expression de HrtBA est régulée par HssSSA chez S. aureus et HssSGBS chez GBS, les deux protéines partageant 30% d’identité. De manière surprenante, nos résultats expérimentaux établissent qu’au contraire de la plupart des senseurs de TCS qui détectent des changements dans l’environnement des bactéries, HssSSA et HssSGBS sont activés, non pas par l’hème extracellulaire mais par le pool d’hème internalisé. De plus, nos résultats in silico et expérimentaux suggèrent que HssSSA détecte l’hème intracytoplasmique tandis que HssSGBS serait sensible à l’hème accumulé dans la membrane. Dans ce contexte, le projet « HemeDetox » a deux objectifs : i) élucider les mécanismes de l’activation de HssS chez S. aureus et chez GBS ; ii) cribler une banque de molécules pour identifier des antagonistes de l’activation de HssS chez S. aureus. Pertinence scientifique et impact du projet « HemeDetox » :. Mécanisme- Les approches expérimentales envisagées permettront de révéler les mécanismes moléculaires qui permettent la détection (liaison directe ou indirecte à l’hème) et la transduction du signal hème par HssS. Concept- Les découvertes issues de ce projet permettront d’établir un nouveau paradigme original de l’adaptation bactérienne en démontrant que le transporteur d’efflux HrtBA, très conservé parmi les bactéries à Gram positif, est régulé par des mécanismes moléculaires distincts selon les pathogènes. Nos résultats pourraient donc ajouter un nouveau niveau de compléxicité des mécanismes adaptatifs des pathogènes. Application- En raison des problèmes de santé publique posés par S. aureus et la démonstration de l’importance de l’homéostasie de l’hème dans la virulence, une inhibition spécifique de la reconnaissance de l’hème par HssSSA pourrait constituer une stratégie antibiotique efficace. Nous proposons une approche originale de criblage haut-débit d’une banque de molécules inhibitrices ciblant spécifiquement la liaison de l’hème à HssSSA.

Les facteurs de remodelage de chromatine ATP-dépendants (les remodeleurs) sont mutés de façon récurrente dans les cancers humains. Nous avons récemment publié une étude à l’échelle du génome de la fonction des remodeleurs en cellules souches embryonnaires (ES) (De Dieuleveult et al., Nature 2016). Cette étude a révélé la liaison sélective des remodeleurs sur les éléments promoteur et enhancer des gènes. De manière inattendue, nous avons également détecté la liaison des remodeleurs sur les éléments CTCF. La protéine CTCF se lie à l’ADN et participe au partitionnement du génome en domaine de chromatine distincts. Cette organisation aurait pour but de réduire les possibilités de contact illégitimes entre les (onco)gènes et les enhancers non liés. En combinant les expertises des trois partenaires du projet, nous allons analyser la fonction des remodeleurs de chromatine au niveau des sites CTCF, et définir comment ils contribuent à l’organisation 3D du génome. Notre projet 3D-reMODEL comprend quatre objectifs pour étudier de manière systématique le lien fonctionnel entre les remodeleurs et le duo CTCF/Cohesin dans la structuration 3D du génome mammifère. Ce projet permettra aussi de définir comment la collaboration entre les remodeleurs et CTCF pourrait contribuer au phénotype cancéreux. 1. Nous définirons comment CTCF co-localise avec neuf remodeleurs différents, avec des spécificités d’orientation, aux niveau des sites CTCF marquant les limites de différents domaines 3D (TADs versus différentes catégories de sub-TADs) dans les cellules ES murines. 2. Nous étudierons grâce à une approche ChIP-seq comment les neuf remodeleurs régulent la liaison et la stabilisation de CTCF et du complexe Cohesin. Nous déterminerons également comment CTCF contribue au recrutement des remodeleurs sur le génome. 3. Nous proposons également de disséquer la nature des interactions entre CTCF et les remodeleurs sur le génome en testant les interactions directes entre ces facteurs. Nous caractériserons le réseau des interactions protéine-protéine du duo CTCF/Cohesin grâce à des approches de co-immunoprécipitation couplées à une analyse par spectrométrie de masse. 4. En utilisant une combinaison d’approches Hi-C et HiChIP, nous analyserons les conséquences de la perte de fonction de chacun des remodeleurs sur la formation des différents domaines 3D de chromatine. En particulier, nous évaluerons si la régulation par Brg1 de domaines 3D pourrait expliquer sa fonction de suppresseur de tumeur. Nous avons réalisé une série d’expériences préliminaires dans lesquelles nous avons cartographié par ChIP-seq le profil de liaison de CTCF sur le génome, dans des cellules ES normales ou déplétées en Brg1, Chd4 ou Ep400. Nous avons établi que la perte de fonction de chacun de ces trois remodeleurs altère subtilement, et avec un profil spécifique, la liaison de CTCF sur le génome. Ces données suggèrent que les remodeleurs présents au niveau des sites CTCF ont des fonctions régulatrices spécifiques dans la formation des domaines 3D de chromatine. Il est donc important de tester comment les autres remodeleurs régulent la liaison de CTCF, si CTCF lui-même est impliqué dans le recrutement des remodeleurs, et comment les changements de liaison de CTCF perturbent l’organisation 3D du génome des cellules ES.

La sénescence cellulaire participe au vieillissement des mammifères. Afin d’identifier des nouveaux régulateurs et biomarqueurs de la sénescence cellulaire, nous avons caractérisé la chromatine des fibroblastes humains sénescents avec une méthode de profilage des histones que nous avons développée (Contrepois et al., 2010, 2012). De façon remarquable, nous avons découvert une forte accumulation d’un nouveau variant d’histone, H2A.J (Uniprot Q9BTM1) dans la chromatine des fibroblastes humains en sénescence avec des dommages persistants à l’ADN. H2A.J se trouve à faible niveau dans des fibroblastes en prolifération ou en quiescence induite par une carence en sérum. Comme pour H2A.X, H2A.J est exprimé pendant tout le cycle cellulaire et contient un motif SQ phosphorylable dans sa séquence C-terminale. Ces deux caractéristiques distinguent H2A.J et H2A.X des histones H2A canoniques. Dans un article que nous venons de publier dans Nature Communications (Contrepois et al., 2017), nous avons démontré que la déplétion de H2A.J n’empêche pas l’entrée ou la maintenance de la sénescence induite par des dommages à l’ADN, mais cette dépletion inhibe fortement l’expression des gènes d’inflammation qui contribue au SASP (Senescence-Associated Secretory Phenotype). Hypothèses scientifiques : nous proposons que H2A.J pourrait représenter un nouveau biomarqueur de cellules sénescentes in vivo, et qu’il contribue à l’expression d’un phénotype d’inflammation chronique pendant le vieillissement. Cette inflammation chronique est impliquée dans le développement des maladies associées au vieillissement. Ojectifs : pour ce projet, nous voudrions répondre aux questions suivantes : 1) quel est le mécanisme par lequel H2A.J favorise l’expression des gènes d’inflammation en sénescence ? 2) Quels types cellulaires expriment H2A.J in vivo, et est-il un biomarqueur intéressant pour des cellules sénescentes in vivo ? 3) Y a-t-il des fonctions pour H2A.J qui sont indépendentes de la sénescence, notamment par rapport au système immunitaire ? 4) H2A.J favorise-t-il l’installation d’une inflammation chronique pendant le vieillissement ? Nous utiliserons notre souris H2A.J knock-out afin de répondre aux deux dernières questions.

La recombinaison homologue, qui joue un rôle crucial dans la stabilité des génomes, est le Dr Jekyll et Mr Hyde de la génétique. Du coté positif, les crossing-over générés par recombinaison homologue génèrent de nouvelles combinaisons alléliques et sont donc au cœur de l’hérédité et de l’évolution. En outre, les crossing-overs sont essentiels pour la ségrégation des chromosomes lors de la méiose. Des défauts de crossing-over sont associés à des aneuploïdies telles que la trisomie 21, ainsi qu’à des problèmes d’infertilité. Néanmoins, le nombre de crossing-over est bas chez la plupart des eucaryotes, suggérant qu’un niveau élevé de recombinaison est contre-sélectionné. Plus encore, alors que la recombinaison homologue est un mécanisme essentiel de réparation, une hyper-recombinaison dans les cellules somatiques peut mener à des pertes d’hétérozygotie et de gros réarrangements, qui sont centraux dans les mécanismes de carcinogénèses et sont aussi moteur dans certaines maladies neuro-dégénératives. La régulation de la recombinaison homologue est donc de première importance à la fois pour la diversité et pour l’intégrité des génomes Le projet FIRE s’appuie sur la découverte récente d’un nouveau complexe anti-crossover dans le laboratoire du coordinateur. Un crible génétique dédié, mené chez Arabidopsis, a permis d’identifier deux protéines largement conservées, FIDGETIN-LIKE1 (FIGL1, Girard et al 2015) et FIDGETIN-LIKE1-Interacting-Protein (FLIP, unpublished data). Ces deux protéines forment un complexe qui limite la recombinaison méiotique. De plus, FIGL1 et FLIP interagissent génétiquement et physiquement avec DMC1 et RAD51 qui s’associent avec l’extrémité de l’ADN cassé et catalysent l’étape centrale d’invasion d’une molécule d’ADN homologue intacte. FIGL1 a aussi été impliqué dans la recombinaison homologue dans les cellules humaines en culture. Le complexe FIGL1/FLIP représente donc potentiellement un nouveau régulateur direct de l’étape d’invasion de la recombinaison homologue, via la régulation des recombinases RAD51/DMC1. FIGL1 appartient à la famille de protéines des AAA-ATPases, qui régulent négativement leur cible en démantelant leur structure 3D, il est tentant de suggérer que le complexe FIGL1/FLIP régule négativement la recombinaison en réduisant directement l’activité de DMC1/RAD51. En s’appuyant sur ces résultats préliminaires robustes, le projet FIRE implique des équipes extrêmement complémentaires pour : 1) Etablir l’activité biochimique du complexe FIGL1/FLIP. Nous allons notamment explorer l’effet de FIGL1/FLIP sur la capacité de RAD51/DMC1 à former des filaments sur l’ADN et à catalyser l’échange de brins. 2) Explorer la fonction in vivo de FIGL1/FLIP à la fois chez les plantes et les mammifères. Nous allons ainsi tirer parti des avantages respectifs des deux modèles, et explorer la conservation évolutive de la fonction de FIGL1/FLIP. 3) Disséquer plus avant la régulation de l’étape d’invasion de la recombinaison par la caractérisation d’antagonistes de FIGL1/FLIP. Pour cela, nous avons mis au point un crible génétique, qui a déjà montré son efficacité en identifiant un premier antagoniste. Le Projet FIRE devrait apporter un nouvel éclairage sur la régulation de la recombinaison homologue et donc sur le contrôle de la stabilité et de la diversité des génomes. Les résultats de ce projet auront un écho auprès d’une large communauté scientifique. Ils pourront aussi ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques pour les maladies génétiques résultant d’instabilité génétique.

L'objectif du projet NHEJLIG4 est d’apporter une meilleure compréhension du mécanisme de la voie NHEJ classique (c-NHEJ) en mettant l'accent sur les interactions dynamiques impliquant l'ADN Ligase 4 (LIG4). Dans les cellules de mammifères, la c-NHEJ est la voie prédominante pour la réparation des cassures double brin de d'ADN telles que celles induites lors de la recombinaison V(D)J durant la réponse immunitaire adaptative ou celles induites par divers clastogènes comme les rayonnements ionisants. Bien que la plupart des effecteurs de la machinerie de base de la c-NHEJ soient connus, leurs rôles spécifiques ainsi que la dynamique de leurs interactions restent encore mal compris. Afin de mieux comprendre la dynamique d’action de la machinerie de la c-NHEJ lors de ses interactions avec les cassures double brin de l'ADN, nous combinerons ici des approches biochimiques d’ensemble avec des approches de visualisation en molécules uniques, et des approches structurales. De plus, les transactions dépendantes de la LIG4 seront étudiées à l'intérieur des cellules. Les objectifs spécifiques seront de déterminer le mécanisme moléculaire par lequel la protéine XLF stimule le complexe LIG4/XRCC4 de manière dépendante de Ku. En outre, nous définirons la base moléculaire de la fonction structurelle et non catalytique du complexe LIG4/XRCC4. Les résultats issus de ce projet interdisciplinaire permettront d’obtenir une compréhension mécanistique détaillée de la fonction et de la régulation du complexe LIG4/XRCC4 qui permettra de mieux comprendre l’extraordinaire flexibilité et adaptabilité de la machinerie de la c-NHEJ lors de la réparation des cassures double brin de l’ADN.

L’homéostasie des protéines, essentielle pour la cellule, fait intervenir de nombreuses étapes de contrôle et régulations. Elle nécessite le maintien d’un pool de ribosomes actifs et également un contrôle qualité des ARN messagers et des peptides produits. Ces deux évènements sont liés aux dernières étapes de la traduction, terminaison et recyclage, qui consistent à relarguer le peptide naissant et à dissocier les deux sous-unités de manière à recycler les ribosomes. L’intégrité des messagers est contrôlée à cette étape de la traduction. Si le messager est «conforme», la terminaison va s’effectuer à l’aide des facteurs de terminaison eRF1 et eRF3 et du facteur de recyclage Rli1. Dans les cas de messagers défectueux, tels que des messagers sans stop (Non-Stop mRNA decay-NSD) ou qui, pour diverses raisons, vont ralentir ou bloquer le ribosome (No-Go mRNA decay-NGD), des paralogues d’eRF1 et eRF3, Dom34 et Hbs1, assistés de Rli1 vont intervenir pour dissocier et recycler les ribosomes bloqués. Il semblait donc difficilement imaginable de trouver des ribosomes dans les régions 3’ non-traduites (3’UTR). Cependant, il a récemment été montré que, lors d’un défaut de recyclage des ribosomes ceux-ci pouvaient se retrouver dans les 3’UTR. Ces résultats indique également que des ribosomes sont présents dans les 3’UTR dans un contexte sauvage. Il y a deux possibilités pour libérer ces ribosomes-3’UTR: i) soit ils ré-initient la traduction et dans ce cas, la traduction se terminera de manière classique avec l’intervention d’eRF1 et eRF3 ; ii) soit ces ribosomes seront dissociés par les facteurs Dom34/Hbs1 comme dans le cas de NSD/NGD. La découverte de ces ribosomes non-recyclée est très récente et ouvre un champ de recherche très prometteur. Le but de ce projet est de caractériser la nature des ribosomes présents dans les 3’UTR et de comprendre pourquoi certains vont ré-initier la traduction et d’autres pas. La première partie de ce projet va consister à identifier les facteurs intervenant dans ce processus. Ceci va être réalisé par des cribles génétiques (avec des gènes rapporteurs adaptés, des cribles de surexpression, de léthalité synthétiques et double-hybride). Ensuite, ces facteurs seront utilisés pour réaliser des purifications par affinité afin d'identifier leurs partenaires. Nous avons déjà identifié deux facteurs jouant un role dans cette voie. L’un d’eux, une RNA hélicase de fonction inconnue, que nous avons appelé Tac4 (Translation Associated Component 4) est associé aux polysomes et présent dans les 3’UTR. Ces résultats préliminaires montrent la faisabilité du projet. Des résultats suggèrent que des motifs ARN dans les 3’UTR pourraient avoir un rôle dans la dissociation et le sauvetage des ribosomes. Nous projetons d'identifier les éléments agissant en «cis» responsables de ce phénomène. Leur caractérisation sera réalisée par la combinaison d’expériences utilisant des rapporteurs adéquates et une analyse bioinformatique à partir des séquences/structures sélectionnées. Par ailleurs, des approches génomiques vont être effectuées. Le CRAC (dérivée de la méthode de CLIP-seq) ou des expériences de RIP-seq nous renseigneront sur les cibles spécifiques de ces complexes ou facteurs. Enfin, le ribosome profiling nous donnera une image de l’état traductionnel des ribosomes associés à ces facteurs particuliers. Bien que ce projet soit un projet de recherche fondamental, nos résultats devraient aussi avoir un impact sur la compréhension des ribosomopathies. En effet, l’accumulation des ribosomes en 3’UTR va perturber l'homéostasie du ribosome et entrainer ce que l'on appelle des ribosomopathies. Ces maladies, cliniquement distinctes, sont toutes liées à un défaut dans l'homéostasie du ribosome. Certaines entrainent une réduction du nombre de globules rouges, alors que d'autres entrainent des défaut du squelette et des retards de croissance.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative progressive, caractérisée par des troubles cognitifs et moteurs provenant de la dégénérescence préférentielle des neurones du striatum. Elle est causée par une expansion de trinucléotides CAG dans le gène Huntingtine (HTT). Les symptômes se mettent en place lors d’un longue période de dysfonctionnement neuronal, précèdant la neurodégénérescence. Cette période, que récapitulent les modèles murins Huntington, représente une fenêtre intéressante d’un point de vue thérapeutique. A ce stade, des altérations transcriptionnelles précises apparaissent dans le striatum, notamment une baisse de l’expression de marqueurs de l’identité striatale. Nos données récentes suggèrent que des mécanismes épigénétiques sont à l’origine des ces dérégulations transcriptionnelles. Elles résulteraient d’une réduction de l’activité des super-enhancers, causée par une diminution sélective de l’acétylation de H3K27 et de la transcription associée à ces enhancers (eRNAs). A partir d’un modèle murin de la maladie, nous avons pour objectif d’étudier ce mécanisme, de déterminer son rôle dans la pathogénèse et d’identifier des voies d’un intérêt thérapeutique. Nos résultats suggèrent que deux mécanismes non-exclusifs pourraient être à l’origine de l’altération des super-enhancers striataux dans la MH : un défaut d’activité de l’histone acetyltransférase CBP et un défaut d’activité du facteur de transcription SRF. Les voies CBP et SRF seront modulées chez le modèle souris Huntington R6/1, à l’aide d’approches pharmacologique et basée sur l’utilisation de vecteurs viraux. Les effets induits par la manipulation des voies CBP et SRF sur l’épigenome et le transcripitome striatal des souris R6/1 seront ensuite déterminés par des analyses RNAseq et ChIPseq (Tâche1). Les enhancers régulent l’expression de leurs gènes cibles grâce aux boucles que forme la chromatine et qui favorisent les interactions enhancers/promoteurs. Afin de préciser la relation entre l’altération des super-enhancers et la baisse d’expression de leurs gènes cibles dans le striatum Huntington, nous déterminerons, si l’interaction promoter/super-enhancer est perturbée dans le striatum des souris R6/1 en utilisant la méthode du 4Cseq (Tâche2). Nous faisons l’hypothèse que l’altération de l’activité des super-enhancers striataux, en conduisant à une diminution de l’expression de gènes essentiels à la fonction striatale, joue un rôle clé dans la pathogénèse Huntington. Aussi, une stratégie thérapeutique visant à globalement augmenter l’expression des gènes sous le contrôle des super-enhancers permettrait de contrer le processus pathogénique. Cette hypothèse sera testée en évaluant les conséquences fonctionnelles issues de la manipulation des voies CBP et SRF. Des analyses électrophysiologiques, d’imagerie du cerveau et comportementales seront effectuées à cette fin. Une alternative à cette approche est de considérer que peu de gènes régulés par un super-enhancer ont un effet majeur sur la pathogénèse Huntington, et qu’il peut être suffisant d’augmenter leur expression pour observer un bénéfice substantiel. Dans ce contexte, les gènes qui régulent la structure de la chromatine sont particulièrement intéressants. Nous avons récemment identifié un tel gène, Dclk3. Nous modulerons son expression dans le striatum de souris R6/1 et contrôles et déterminerons son rôle dans la maladie en combinant analyses moléculaires, fonctionnelles et comportementales (Tâche3). EpiHD, en réunissant des approches de pointe, complémentaires et hautement résolutives, devrait conduire à des avancées majeures dans le domaine de la maladie de Huntington et de la discipline émergente que constitue la neuroépigénétique. La validation de cibles nouvelles (CBP, SRF, DCLK3) jouera un rôle de pionnier en matière de recherche de thérapies épigénétiques pour la maladie de Huntington et d’autres maladies neurodégénératives.

Les modifications post-traductionnelles des protéines contribuent de façon majeure à la diversité du protéome. Bien que plusieurs chaines latérales des acides aminés soient modifiées, la lysine est la cible la plus fréquente et elle est sujette à une grande variété de modifications. La méthylation des lysines est étroitement régulée chez l’homme avec plus de 50 enzymes qui contrôlent son transfert et le degré de méthylation (mono, di ou tri –méthylation). Son rôle dans la régulation de la structure de la chromatine a été largement étudié et les liens entre les différents sites de méthylation et l’état transcriptionnel de la chromatine sont bien décrits. En revanche, nos connaissances sur la méthylation de protéines autres que les histones sont encore très limitées. La plupart des enzymes catalysant cette modification appartiennent à la famille des protéines contenant un domaine SET. Ce domaine de près de 130 acides aminés est responsable du transfert du groupe méthyle du cofacteur SAM (S-adenosyl-L-methionine) au groupe ?-amino du résidu lysine. Le « polycomb repressive complex 2 », PRC2, est composé de quatre protéines. EZH2, sa sous-unité enzymatique, est responsable du transfert de méthyle (di et tri –méthylation) sur la lysine 27 de l’histone H3. Son activité est nécessaire pour la maintenance de la répression transcriptionnelle. En conséquence, modifier son activité interfère avec de nombreux processus biologiques tels que la différentiation, la prolifération cellulaire ou la maintenance de l’identité cellulaire. Des mutations altérant son activité ont été trouvées dans diverses pathologies comme le syndrome de Weaver ou certains cancers. Alors que les histones ont longtemps été considérées comme le principal substrat de PRC2, plusieurs études ont maintenant montré que PRC2 peut également méthyler des protéines non-histones. La contribution de ces autres substrats potentiels à la fonction de PRC2 reste énigmatique et une analyse complète du méthylome de PRC2 est manquante. Nous proposons de combler ce manque en utilisant des approches innovatrices à l’interface entre la chimie et la biologie pour dresser une liste exhaustive des substrats du complexe PRC2. En pratique, les substrats seront marqués grâce à l’utilisation d’analogues du donneur de méthyle (SAM) pris en charge par une enzyme modifiée. Le groupement ainsi déposé à la place du méthyle pourra ensuite être couplé à d’autres composés chimiques permettant soit la purification par affinité soit la détection par fluorescence de ces modifications. Cette approche nous permettra de détecter spécifiquement les substrats de PRC2, même si une autre enzyme régule également cette modification et même si cette modification est dynamique. Une fois identifiée, nous étudierons le rôle biologique de ces nouvelles modifications.

La façon dont les cellules déchiffrent l'information de leur environnement, traitent cette information par le biais de leur réseau moléculaire interne et prennent une décision est l'une des grandes questions de la biologie moderne. Les explications classiques des mécanismes moléculaires contrôlant ces processus de prise de décision cellulaire sont généralement basées sur des mesures de populations de cellules en supposant que la réponse de la population moyenne est typique de la plupart, sinon de la totalité, des cellules de la population. Au cours de ces dernières années, il est devenu évident que la variabilité de l'expression des gènes ne pouvait et ne devait pas être ignorée puisque cette variabilité reflète les processus moléculaires stochastiques intrinsèques et fournit des informations sur le réseau moléculaire sous-jacent. La variabilité entre les cellules a même été démontré jouer un rôle fonctionnel important dans le processus de prise de décision cellulaire. L'objectif principal de ce projet est de répondre à la question suivante: comment l'héritabilité, la stochasticité et les réseaux de régulation contribuent-ils à la prise de décision dans des cellules métazoaires au cours d'un processus de différenciation? A cet effet, nous couplerons l'interrogation phénotypique et moléculaire de cellules uniques subissant un processus de différenciation physiologique dans deux systèmes cellulaires complémentaires dérivés de cellules non génétiquement modifiées, à savoir les cellules progénitrices érythrocytaires aviaires et les cellules CD34 + humaines. En utilisant deux systèmes de différenciation distincts, nous serons en mesure de distinguer entre des résultats généralisables et des résultats spécifiques au système étudié. L'objectif le plus ambitieux du projet est de pouvoir déconvoluer, à la fin du projet, le processus décisionnel en contributions spécifiques provenant de fluctuations stochastiques de diverses sources (répartition inégale à la division, régime de bursting), des changements coordonnés y compris ceux résultant des interactions au sein du réseau moléculaire) et la mémoire épigénétique. Ce projet réunira un consortium interdisciplinaire avec les objectifs suivants: 1. Créer un nouveau dispositif microfluidique qui permette de suivre les lignées cellulaires au niveau de la cellule unique et de coupler ce dispositif avec une évaluation transcriptomique à l’échelle de la cellule unique; 2. Évaluer et établir le rôle de l'héritabilité dans les processus de prise de décision cellulaire pendant la différenciation cellulaire; 3. Établir une méthode de pointe pour l'inférence dynamique d’un réseau de régulation génique à partir de données de transcriptomique en cellule unique, incorporant le rôle fonctionnel du bruit; 4. Effectuer des expériences de validation pour les prédictions les plus pertinentes de notre modèle. Le projet créera un cadre holistique pour intégrer des expériences et des observations à l’échelle de la cellule unique (transcriptomique/épigénomique de cellules uniques lors d'un processus de différenciation couplé à des observations en temps réel utilisant des dispositifs microfluidiques dédiés) avec une analyse de données avancée comprenant la création de modèles dynamiques de processus moléculaires contrôlant la différenciation.

La recombinaison méiotique est un élément déterminant de la reproduction sexuée : elle est indispensable non seulement à la stabilité des espèces (production de gamètes haploïdes à partir de cellules diploïdes) mais aussi à leur variabilité (réassortiment du matériel génétique d’une génération à l’autre). La recombinaison méiotique est initiée par la formation de très nombreuses cassures double brin (CDB) de l’ADN générées par la protéine SPO11. Depuis sa découverte, il y a plus de 20 ans, peu de progrès ont été faits quant à la compréhension du mode d’action de SPO11, et ce notamment car sa purification a, jusqu’à maintenant, été infructueuse. Ce projet s’appuie sur le fait que nous avons récemment démontré que SPO11 était membre d’un complexe protéique apparenté aux topoisomérases VI des Archées, enzymes responsables de changements topologiques de l’ADN (Vrielynck et al. Science 2016). Ce résultat a considérablement modifié l’idée que nous nous faisions de la nature et de la structure du complexe catalytique de formation des CDB méiotiques (Bouuaert and Keeney, Science 2016). Il permet de ré-envisager, pour la première fois depuis longtemps, la caractérisation biochimique de la réaction enzymatique à l’origine de la recombinaison méiotique. Pour relever ce défi nous avons réuni dans ce projet collaboratif international Franco-Taiwanais quatre groupes spécialistes dans l’étude biochimique des topoisomérases. Notre consortium est complété par deux groupes spécialistes de l’étude de la méiose dans deux espèces végétales très complémentaires : Arabidopsis thaliana et le maïs, Zea mays. Ceci nous permet de proposer une approche multi-échelle et multidisciplinaire, combinant la génétique moléculaire, la cytologie, la biochimie et la biologie structurale de façon à comprendre les mécanismes contrôlant l’initiation de la recombinaison méiotique. De plus, les plantes sont parmi les rares organismes eucaryotes à coder pour un « vrai » complexe topoisomérase VI (non méiotique). Ceci nous offre l’opportunité de comparer, au sein d’un même organisme, le complexe de formation des CDB méiotiques avec un complexe topoisomérase «classique », offrant ainsi la possibilité d’étudier le mécanisme d’initiation de la recombinaison méiotique d’un point de vue mécanistique et évolutif.

La Sonocytology et une discipline émergente de la biophysique qui étudie les mouvements nanométriques d’origine métabolique de la surface des cellules. Malgré leur observation dans de nombreux organismes, l’origine de ces mouvements et leur fonction biologique reste inconnue. Goodvibrations a été développé à partir de faisceaux de données préliminaires qui montre que les plantes produisent des oscillations associées à la croissance à 1.5KHz et regroupe des spécialistes de la paroi cellulaire, du développement des plantes, de l’acoustofluidic et de la matière molle. Le projet est de développer les outils pour mesurer à la fois les oscillations à la surface des cellules, la rhéologie de la paroi, la pression de turgescence et la l’exocytose des composés le la paroi afin d’étudier le couplage antre la synthèse pariétale et la rhéologie de la paroi mais surtout étudier si les oscillations de surface sont générées ou associées a ce couplage. Grace à ce travail nous espérons éclairer d’un nouveaux jour les caractéristiques remarquables de la paroi cellulaire ouvrant une nouvelle vois de modélisation de la croissance des plants mais aussi au développement de nouveaux matériaux intelligents.

La division cellulaire (mitose) est un processus fondamental nécessaire à la génération d'organismes multicellulaires, au renouvellement des tissus et à la reproduction asexuée. La mitose permet la distribution égale du matériel génétique entre les deux cellules filles. L’entrée en mitose doit être coordonnée avec la réplication de l’ADN afin d’assurer la stabilité du génome. En effet, une entrée prématurée en mitose peut contribuer à l'instabilité génétique, qui est à l’origine de nombreuses pathologies et notamment des cancers. L'entrée en mitose est contrôlée par des protéines kinases ainsi que des phosphatases conservées au cours de l’évolution. Cependant, comment ces activités kinases sont régulées et coordonnées dans l'espace et dans le temps pour déclencher l’entrée en mitose au bon moment reste mal compris. La kinase Plk1 est essentielle pour la ségrégation des chromosomes en mitose. Plk1 contrôle la maturation des centrosomes, la condensation des chromosomes, l’assemblage du fuseau mitotique, la séparation des chromatides soeurs et la cytokinèse. Nous avons récemment montré que Plk1 est activée de manière soudaine juste avant la mitose, et qu’elle est essentielle pour l’entrée en mitose (Gheghiani et al. Cell Reports, en révision). Nous avons montré qu’un complexe Cyclin A2-Cdk, qui coordonne la phase S et la mitose, est requis pour activer Plk1. Nous avons également découvert que Plk1 est activement recrutée à l'enveloppe nucléaire et contribue à sa rupture en prophase (Martino et al. Developmental Cell, en révision). Cependant, les mécanismes et les voies qui activent Plk1 dans l'espace et le temps pour déclencher une entrée irréversible en mitose ne sont pas connus. De même, le mécanisme de recrutement de Plk1 à l’enveloppe nucléaire et son rôle dans la rupture de l’enveloppe restent à déterminer. L'activation de Plk1 dépend de sa phosphorylation sur un résidu conservé (Thr210) situé dans sa boucle d'activation par la kinase Aurora A (AurkA). Ce processus nécessite la protéine Bora, qui stimule la phosphorylation de Plk1 par AurkA. La phosphorylation de Bora par Cdk1/2 est critique pour l'activation de Plk1. L'identité du complexe Cyclin-Cdk impliqué, la régulation spatio-temporelle de la phosphorylation de Bora et le mécanisme par lequel Bora phosphorylée déclenche l'activation de Plk1 et l'entrée en mitose restent méconnus. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire (biologie cellulaire, génétique, biochimie et biologie structurale) dans trois organismes modèles (Xénope, cellules humaines, C. elegans) afin d’identifier le mécanisme précis d’activation, ainsi que les fonctions de Plk1 lors de l'entrée mitose. Nous disposons de l'expertise complémentaire nécessaire en biochimie, en biologie structurale et en biologie cellulaire, ainsi que les outils et les méthodologies pour atteindre nos objectifs. • Nous identifierons le mécanisme d'activation Plk1 par Bora et AurA. Plk1 est une kinase centrale du cycle cellulaire, qui est dérégulée dans de nombreux cancers. Comprendre son mécanisme d'activation revêt d'une importance fondamentale pour le développement de stratégies à visées thérapeutiques. À cet égard, cette partie du projet aura des implications sociétales et économiques importantes. Le développement d'inhibiteurs de Bora et leur utilisation en association avec des inhibiteurs de Plkl déjà disponibles représente une stratégie attrayante pour inhiber Plk1 de façon robuste. • Nous déterminerons comment la kinase CyclinA-Cdk1/2 déclenche l’entrée en mitose. CyclinA s’associe à Cdk2 puis à Cdk1 pour coordonner la réplication de l'ADN et la mitose. Comprendre le rôle de la CyclinA est critique pour déterminer comment la réplication et la mitose sont coordonnées au cours du cycle cellulaire. • Nous déterminerons le rôle de Plk1 dans la rupture de l'enveloppe nucléaire, qui est une étape essentielle permettant la libération des chromosomes et leur ségrégation entre les cellules filles.

La morphogenèse et la motilité cellulaire sont des processus cruciaux à toutes les étapes de la vie, depuis le développement jusqu’à l’homéostasie des tissus, et sont associées des états pathologiques tels que les cancers. Les cellules migrantes doivent rapidement adapter leur programme morphogénétique aux conditions continuellement changeantes de l’environnement, ce qui implique une intégration spatiotemporelle finement régulée d’une variété de signaux biochimiques et physiques. Comprendre comment les cellules en migration lisent et interprètent ces stimuli mécano-chimiques est un des grands challenges de la biologie cellulaire moderne. La machinerie d’acto-myosine est le moteur principal de la locomotion qui en poussant et/ou en tirant sur la membrane plasmique contrôle l’extension de protrusions, la formation de nouvelles adhérences à l’avant des cellules, et leur détachement à l’arrière. Ces processus dépendent et influencent la tension de la membrane cellulaire. De plus, les obstacles rencontrés sur le chemin des cellules en migration ainsi que la géométrie de l’environnement traversé peuvent également perturber localement la tension membranaire. Ainsi, la tension membranaire est un intégrateur clé des signaux mécaniques et a été impliquée dans la migration cellulaire. Les partenaires P1 &P3 ont récemment démontré que les cavéoles, ces petites invaginations de la membrane plasmique, tamponnent la tension de membrane en s’aplatissant dans celle-ci lorsqu’elle se tend suite à un stress mécanique. Les données préliminaires de P1 suggèrent de plus que l’aplatissement des cavéoles est également associé à la régulation sélective de cascades de signalisation et au contrôle de la transcription de certains gènes. Les résultats préliminaires de P2 suggèrent par ailleurs que les cavéoles peuvent directement détecter les modulations de tension de membrane au travers un réseau 3D organisé de fibres de collagène. Alors que la tension de membrane et les cavéoles ont toutes deux été impliquées dans certains aspects de la migration cellulaire, on ne sait pas si la modulation de la tension de membrane par les cavéoles joue un rôle dans la motilité cellulaire. Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle des cavéoles et de la tension de membrane au cours de la migration. Nous déterminerons comment, en impactant la tension de membrane, les cavéoles régulent la migration. Nous étudierons comment les cavéoles, en contrôlant des voies de signalisation sélectives et la mécanotransduction, peuvent avoir un impact sur la motilité cellulaire. Enfin, nous déterminerons comment les signaux chimiques et mécaniques ressentis par les cavéoles sont intégrés avec l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine pour orienter la migration cellulaire.

Les programmes visant à éradiquer le paludisme sont confrontés à la persistance de Plasmodium vivax, une espèce de parasite à prévalence globalement, dans les régions où P. falciparum a presque disparu. La résilience de P. vivax est principalement due à sa capacité de former des formes hépatiques dormantes (hypnozoïtes), dont certaines sont activées au cours des mois après la piqûre infectante pour causer des relapses, maintenant ainsi la transmission. L’unique drogue (primaquine) disponible pour éliminer les hypnozoïtes a des effets secondaires potentiellement dangereux, entravant ainsi son utilisation à grande échelle. Il est devenu prioritaire de trouver une alternative sûre ou un vaccin. Pour ce, le criblage à haut débit est impossible car il nécessite des primates non humains (NHP) infectés par P. cynomolgi, un parasite de macaque similaire en tous respects à P. vivax. De plus le manque de connaissances sur la biologie et la biochimie de l’hypnozoïte ne permet pas de guider cette recherche. Ce projet vise à rassembler un consortium combinant des expertises distinctes et complémentaires pour mener les premières observations biologiques sur l’hypnozoïte. Les recherches proposées se focaliseront sur le modèle P. cynomolgi/Macaca fascicularis, et exploiteront des avancées récentes en culture in vitro des formes parasitaires sanguines et hépatiques, manipulations génétiques des parasites, analyses génétiques de cellules individuelles, ainsi qu’en découvertes de nouvelles cibles vaccinales. Il est proposé d’établir ce modèle au IDMIT (CEA, Fontenay-aux-Roses), où l’animalerie et les plateformes techniques de pointes sont un environnement idéal pour des investigations sur des NHP, en collaboration avec les membres du CEA/IMVA experts en recherches fondamentale et précliniques sur des pathogènes viraux et bactériens de M. fascicularis. Trois objectifs principaux sont proposés. Primo, établir les techniques requises pour un accès aux divers stades du parasite, et établir des protocoles d’infection standard nécessaires pour toutes recherches futures. Nous bénéficierons exclusivement d’une souche de P. cynomolgi qui peut être maintenue in vitro pour développer des outils pour générer les parasites génétiquement modifiés pour des études fonctionnelles futures. Secundo, mener des investigations sur la nature fondamentale de la biogenèse de l’hypnozoïte pour établir si les sporozoïtes sont programmés pour former un hypnozoïte ou se développer immédiatement dans l’hépatocyte. Ceci se fera par des analyses transcriptomiques et protéomiques de différents types de sporozoïtes purifiés en populations ou individuellement à partir d’espèces qui forment ou non d’hypnozoïtes. Tertio, évaluer l’efficacité protectrice d’un ensemble d’antigènes, identifiés comme candidats vaccins potentiels chez un modèle rongeur, et pour la première fois l’effet d’une immunisation sur les relapses. Nous sommes conscients de la nature ambitieuse des investigations, et des risques inhérents à l’utilisation de nouvelles technologies pour étudier l’hypnozoïte. Nous sommes confiants de pourvoir amener de nouvelles connaissances suffisantes pour susciter et soutenir de futurs projets qui élargiraient notre compréhension du contrôle de la dormance des hypnozoites. Ces avancées devraient non seulement accélérer la recherche de nouvelles approches contre P. vivax et P. ovale (le deuxième parasite de l’homme prévalent en Afrique capable de former des hypnozoïtes), mais aussi fournir des données fondamentales sur la quiescence cellulaire, un phénomène impliqué dans divers processus biologiques et pathologiques. En définitive, ce projet servira comme une première étape pour établir un centre d’excellence pour la recherche sur les hypnozoïte, et s’adressera éventuellement à d’autres aspects fondamentaux, cliniques et immunologiques de l’infection qui seraient le mieux étudiés chez les primates non humains.

La compétence est un programme génétique de différenciation central et propre au monde bactérien. Elle confère aux cellules la capacité à modifier leur génome via la capture et l’internalisation d’ADN exogène, suivi de son intégration dans leur(s) chromosome(s). Ceci leur permet d’acquérir de nouvelles propriétés et, ainsi, de diriger leur propre évolution. Le mécanisme qui sous-tend ce transfert horizontal d’ADN, communément appelé la transformation génétique naturelle, est très conservé. En revanche, le mode de développement de la compétence et son schéma de régulation varient considérablement entre les espèces bactériennes, reflétant une adaptation particulière de ce programme génétique à leurs physiologies et à leurs styles de vie particuliers. Comment le développement de la compétence pour la transformation génétique se coordonne avec les autres processus du cycle cellulaire est incompris. Ici, nous adresserons cette question via l’analyse du pathogène humain majeur Streptococcus pneumoniae (le pneumocoque), l’un des modèles bactériens le mieux compris et le plus flexible pour l’étude de la transformation génétique. L’induction de la compétence du pneumocoque (le X-State) est abrupte et simultanée dans toutes les cellules d’une culture en phase de croissance exponentielle, dure environ 20 minutes puis se ferme presque aussi abruptement. Pendant cette courte période, une machinerie multiprotéique dédiée à la fixation, l’internalisation et l’intégration d’ADN exogène dans le génome de la bactérie réceptrice (le transformasome) est assemblée dans la membrane cytoplasmique et au travers de la paroi au centre de la cellule, le site de division. De façon remarquable, la croissance de la culture cellulaire est retardée de façon transitoire lors de la compétence du pneumocoque. Notre analyse par microscopie de cellules isolées, montre que le processus de constriction des cellules est aussi retardé dans les cellules compétentes. Cet arrêt peut indiquer l’établissement d’un point de contrôle couplant le processus de transformation avec le cycle cellulaire, et/ou le résultat de la mise en place du transformasome au septum qui pourrait ainsi interférer avec la machinerie de la division cellulaire (le divisome) et/ou en profiter pour son propre assemblage Les objectifs principaux du projet EXStasis sont de comprendre (1) comment la compétence pour la transformation génétique provoque un arrêt de croissance chez le pneumocoque et (2) comment le transformasome est assemblé au niveau du site de division dans des cellules en croissance. Pour cela nous mènerons une approche multidisciplinaire combinant la génétique moléculaire, la protéomique et des techniques de microscopie à fluorescence à très haute résolution. A terme, ce programme qui vise à mieux comprendre le rôle de la compétence et de la transformation dans le cycle de vie d’un pathogène humain majeur, aura aussi un impact scientifique fondamental dans l’avancée des connaissances de deux évènements clés du cycle cellulaire de la bactérie S. pneumoniae, i.e. la division et la synthèse du peptidoglycane. Au-delà de ces aspects fondamentaux, le projet EXStasis pourrait permettre d’identifier de nouvelles stratégies pour bloquer la croissance ou la compétence pour la transformation génétique du pneumocoque, et aboutir à la mise en place de nouveaux programmes de lutte contre ce pathogène.

Les maladies cardiovasculaires représentent un fardeau économique majeur pour les systèmes de soins de santé et l'une des principales causes de mortalité et de morbidité dans le monde. Ces dernières années ont montré que les BMP (Bone morphogenetic proteins) sont une famille de facteurs de croissance qui joue un rôle clé dans le développement vasculaire, et que des défauts de la voie de signalisation des BMP sont impliqués dans plusieurs maladies cardiovasculaires. Bien que de nouvelles thérapies biomédicales ciblant les BMP soient prometteuses, notre compréhension actuelle des voies de signalisation activées par les BMP et leurs rôles pathogènes reste très limitée. Parmi les différentes BMP (plus de 30), il est maintenant bien établi que BMP9 et BMP10 jouent un rôle crucial dans ces pathologies. En 2007, notre équipe a été la première à identifier BMP9 et BMP10 comme ligands de haute affinité pour le récepteur de type 1 ALK1 (activin receptor-like kinase 1) et le récepteur de type 2 BMPR2, deux récepteurs principalement exprimés sur les cellules endothéliales (CE). En accord avec ces données, des mutations dans les gènes codant pour ces deux récepteurs et plus récemment dans le gène codant pour BMP9 sont impliquées dans deux maladies rares : La maladie de Rendu-Osler (HHT, télangiectasies hémorragiques héréditaires) et l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). Les objectifs de ce projet sont de déterminer le rôle de BMP9 dans les pathologies cardiovasculaires. Notre hypothèse est que BMP9 aurait une action vasoconstrictrice pulmonaire qui contribuerait au développement et à la progression du remodelage vasculaire pulmonaire associée à l'HTAP et que donc BMP9 pourrait être une cible thérapeutique intéressante. Cette hypothèse est basée sur des données de la littérature et de solides données de nos deux groupes non publiées qui montrent que des souris invalidées pour Bmp9 (Bmp9-KO) sont moins susceptibles de développer une hypertension pulmonaire (PH) induite par hypoxie chronique ou injection de monocrotaline (MCT)-pyrrole. Pour déchiffrer les mécanismes moléculaires par lesquels BMP9 exercerait son action vasoconstrictrice pulmonaire, nous avons choisi de nous focaliser sur l'HTAP. En effet, des modèles expérimentaux de souris et de rats sont disponibles pour cette pathologie et nous avons développé un répertoire d'outils uniques comprenant des rats Bmp9-KO (générés par la technologie CRISPR-Cas9) et des cultures primaires de CE pulmonaires humaines portant des mutations de BMPR2 ou d’ALK1 provenant de poumons explantés de patients HTAP bien caractérisées. Ces outils originaux nous permettront de mieux comprendre la signalisation par laquelle BMP9 exerce son action vasoconstrictrice pulmonaire (nous avons déjà identifié deux facteurs régulés par BMP9 susceptibles de jouer un rôle dans la vasoconstriction, l’endotheline-1 et l’apeline). Depuis le dépôt de notre lettre d’intention, nous avons obtenu des résultats très intéressants qui supportent notre hypothèse de BMP9 comme régulateur clé de la vasoconstriction pulmonaire : nous montrons qu’un traitement curatif à l’aide d’injection de la forme extracellulaire du récepteur ALK1, qui bloque ses ligands circulants donc BMP9, protège significativement les rats contre le développement d’HTAP expérimentale. Un des objectifs du projet est de confirmer ce résultat dans des modèles bien reconnus d’HTAP chez le rat en utilisant plusieurs approches visant à bloquer BMP9. Le blocage de la voie du BMP9 est une approche thérapeutique contre-intuitive car elle va à l'encontre de l'hypothèse la plus simple qui serait de traiter cette maladie en donnant en excès du ligand de cette voie défectueuse comme précédemment décrit. Au total, ce projet apportera une meilleure compréhension de la voie de signalisation des BMP et une approche thérapeutique innovante non seulement dans l'HTAP, mais aussi dans HHT et toute autre maladie cardiovasculaire impliquant la voie de signalisation des BMP.

Malgré d’importantes avancées thérapeutiques, l’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) reste malheureusement une maladie à issue fatale sans traitement curatif. Les coûts liés aux traitements actuels représentent une préoccupation majeure de santé publique. Les thérapies palliatives actuelles ne ciblent pas l’accumulation des cellules musculaires lisses d’artères pulmonaires (CML-AP) et des cellules inflammatoires à l’origine du remodelage vasculaire pulmonaire, qui conduit progressivement à l’insuffisance cardiaque et au décès. Il est donc urgent de développer des stratégies thérapeutiques qui ciblent spécifiquement le remodelage vasculaire pulmonaire et ses mécanismes sous-jacents, comme l’accumulation de CML-AP et l’inflammation accrue. Les récepteurs cytokiniques de Type I (TypeIR) sont des récepteurs transmembranaires qui possèdent un motif d’acides aminés commun (WSXWS) dans leur portion extracellulaire qui reconnait et répond aux cytokines de Type I. De façon intéressante, plusieurs TypeIR sont surexprimés à la surface des CML-AP chez les patients atteints d’HTAP ou dans les modèles expérimentaux, comme les récepteurs pour l’interleukine (IL)-6, la leptine (Ob), et pour le granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Même si les mécanismes qui controllent l’expression basale des TypeIR, et donc l’ampleur des réponses cytokiniques, sont peu connus, les protéines ring finger protein 41 (RNF41) et ubiquitin-specific protease 8 (USP8) apparaissent clairement comme des acteurs clefs de l’adressage/recyclage des TypeIR. De manière intéressante, mes données préliminaires montrent que les niveaux d’expression élevés de TypeIR peuvent être diminués en modulant RNF41 dans des CML-AP isolées à partir de tissus pulmonaires de patients HTAP. L’objectif de ce projet translationnel est de comprendre si la modulation des protéines régulatrices des TypeIR pourrait représenter une cible thérapeutique innovante dans l’HTAP. Le projet CoVeR présente deux tâches principales qui soulèvent des questions clefs de la physiopathologie de l’HTAP Tâche 1 : Est-ce que la perte du contrôle de l’expression des TypeIR dans les CML-AP et les péricytes contribuent au remodelage vasculaire pulmonaire de l’HTAP ? Tâche 2 : Peut-on moduler l’expression des TypeIR pour stopper/réverser la maladie ? Ce projet fait appel à des stratégies expérimentales originales alliant à la fois des études sur échantillons humains (in situ et in vitro à travers l’utilisation de cultures primaires de CML-AP et de péricytes) et in vivo, en alliant les 3 modèles d’HTAP expérimentale, ainsi que l’utilisation de souris ou rats génétiquement modifiés pour les TypeIR. Ce projet translationnel s’intègre dans les thématiques de notre unité Inserm UMR_S 999, dirigée par le Pr Humbert, comprend les cliniciens de Centre de Référence de l’HTAP (Pr. Humbert), des chirurgiens de l’hôpital Marie Lannelongue (Pr E. Fadel) et des experts en anatomie pathologique (Pr Dorfmüller et Dr Ghigna). L’UMR_S 999 dispose d’un registre de patients (= 1500 patients), d’une biobanque (ADN et serum/plasma de 400 patients), d’une banque de tissus frais explantés (200 échantilons), issus des patients HTAP transplantés à l’Hôpital Marie Lannelongue, ainsi que de patients considérés comme contrôles (soumis à pneumectomie pour tumeurs pulmonaires localisées). A partir de ces échantillons, une banque de cellules isolées de tissus humains (CML-AP et péricytes pulmonaires) en culture primaire a été développée. La restauration des niveaux d’expression des TypeIR, via la modulation des protéines RNF41/USP8, pourrait représenter une stratégie thérapeutique pertinente pour normaliser ces acteurs clefs du remodelage vasculaire de l’HTP, à l’interface entre inflammation et remodelage vasculaire. Cette approche intégrée de mon projet CoVeR pourrait également s’appliquer à d’autres maladies liées à une suractivité des TypeIR.

Les cellules souches et progéniteurs hématopoïétiques (CSPHs) incluant les progéniteurs multipotents (MPPs) résident dans la moelle osseuse (MO) en lien étroit avec des structures spécialisées, les niches endostéales et (péri)-vasculaires. Elles sont à l'origine de la production et du renouvellement des cellules immunes circulantes. La principale divergence des lignages lymphoïde et myéloïde se produit au stade MPP. Les CSPHs et le microenvironnement médullaire établissent des échanges bi-directionnels qui assurent leurs maintiens homéostatiques. Ces processus sont souvent dérégulés en situation pathologique. Les travaux se concentrant sur les MPPs étudient pour la plupart les régulations moléculaires liées à leur spécification vers un lignage. Cependant, notre compréhension de l’influence des facteurs extracellulaires ou de la localisation des MPPs dans la spécification lympho-myeloïde n’est pas résolue. Les progéniteurs lymphoïdes et myéloïdes communs sont générés à partir de sous-populations de MPPs phénotypiquement et fonctionnellement différentes: les MPP2 et MPP3 présentent un biais de différenciation myéloïde alors que les MPP4 seraient responsables du lignage lymphoïde. La localisation et les niches de ces différentes sous-populations de MPPs sont inconnues. Il reste également à déterminer si la localisation régionale des MPPs au sein de la MO influe sur leur spécification au moyen de contacts cellulaires spécifiques et à travers l'implication de facteurs extracellulaires tels que la chimiokine CXCL12. Réciproquement, il reste à définir si les MPPs sont capables de réguler leur propre niche via des interactions avec le stroma médullaire et si oui, par quels mécanismes. Dans ce contexte, les objectifs de ce projet, qui réunit trois partenaires ayant des expertises complémentaires dans l’immuno-hématologie (P1), l’ostéo-immunologie (P2) et la biologie des interactions leuco-stromales (P3), visent à définir le rôle du trio formé par CXCL12 et ses deux récepteurs CXCR4 et CXCR7/ACKR3 dans le maintien de la niche ostéo-vasculaire au sein de la MO et à déterminer l’impact de celle-ci sur la localisation et la spécification des MPPs chez la souris et chez l’Homme. Nous étudierons également si les MPPs régulent leurs niches au moyen de ce trio. La stratégie globale consistera à caractériser l'expression fonctionnelle du trio CXCL12/CXCR4-CXCR7 dans les sous-populations de MPPs et dans les composantes de la niche ostéo-vasculaire, et à établir le transcriptome de ces différents acteurs cellulaires dans le but d’appréhender les interactions moléculaires existant en trans entre les composantes stromales et hématopoïétiques. Nous espérons ainsi identifier des couples ligands/récepteurs impliqués dans la localisation et la spécification des MPPs. Ces expériences seront réalisées chez la souris incluant un modèle original du Syndrome WHIM (SW) qui résulte d’une mutation gain de fonction du gène codant CXCR4 et qui présente une altération des MPPs ainsi qu'une dérégulation de l'expression de CXCL12 dans la MO, et également à partir de prélèvements sanguins et médullaires issus de sujets sains ou atteints du SW.

Classiquement, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont considérées comme de simples fournisseurs d'un nombre suffisant, et équilibré, de cellules matures alors que la régulation de la réaction immunitaire, ainsi que la mémoire à long terme des infections précédentes, ont été jusqu’à maintenant exclusivement attribuées aux cellules différenciées du système immunitaire. Ainsi, seules, les cellules mémoire du système immunitaire adaptatif, lymphocytes B ou T, sont reconnues pour avoir une mémoire immunitaire, qui implique des modifications génétiques, maintenue à long terme dans des cellules dédiées. Plus récemment, un phénomène nommé « immunité entrainée » a été décrit pour les cellules immunitaires innées telles que les cellules NK et les macrophages qui peuvent également maintenir à long terme une mémoire épigénétique. Dans le projet proposé ici, nous voulons étudier si une telle mémoire épigénétique d’un challenge immunitaire antérieur existe au niveau des CSH et si cette mémoire pourrait déterminer les quantités, la composition et l'activation des leucocytes matures produits en réponse à un stimulus secondaire. Nous voulons déterminer quelles sont les voies de signalisation et les changements épigénétiques impliqués au niveau des CSH, en réponse à une infection. Nous analyserons des conséquences directes sur l'engagement myéloïde, la composition en cellules myéloïdes matures produites et les changements épigénétiques à long terme qui pourraient préparer les CSH à répondre plus efficacement à une deuxième stimulation. Nous utiliserons une approche combinée utilisant la des modèles de souris génétiquement modifiées et humanisées, et des approches génomiques sur des cellules murines et humaines pour aborder ces questions, tirant profit de l'expertise complémentaire des laboratoires partenaires. La démonstration de l’existence d’une mémoire épigénétique au niveau des CSH serait une révolution, d’une part en raison de la durée de vie longue de ces cellules et donc de la longévité que cela implique pour leur mémoire et d’autre part parce que les CSH sont au sommet de la hiérarchie de différenciation du système immunitaire et pourraient donc largement influencer les futures réactions immunitaires. Ainsi, les CSH pourraient devenir dans le futur les cibles centrales des recherches en immunologie et des stratégies de vaccination. Cette découverte pourrait aussi avoir un impact majeur sur des questions de santé publique liées à l'hypothèse hygiéniste. Enfin, ceci pourrait également avoir des conséquences importantes pour la gestion des protocoles actuels de transplantation des CSH et même ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour ces transplantations.

Avec 429 000 morts par an, le paludisme, causé par des parasites du genre Plasmodium et transmis par des moustiques anophèles, reste la maladie parasitaire la plus dévastatrice. L’efficacité des bi/tri-thérapies basées sur l’artémisinine (ACT) est menacée par l’émergence de résistances parasitaires. De plus, l’OMS a fait de l’interruption de la transmission une priorité pour laquelle de nouvelles stratégies d’intervention doivent être développées. Nous proposons d’étudier le mode d’action de deux molécules, la primaquine (PQ) et la plasmodione (PD), qui sont actives sur les gamétocytes, les formes parasitaires responsables de la transmission du parasite de l’homme au moustique. PQ est le seul antipaludique actif contre les gamétocytes matures actuellement utilisé en clinique et est en cours d’évaluation pour une utilisation à large échelle en combinaison avec les ACTs. PD et ses dérivés sont de nouvelles têtes de séries présentant une activité antipaludique rapide et une capacité àbloquer la transmission du parasite. PQ, PD et dérivés exercent leur activité anti-Plasmodium via des mécanismes d’oxydo-réduction pléiotropes encore mal compris à ce jour. Alors que leur bio-activation est distincte, leurs modes d’action semblent partager certaines caractéristiques communes. En effet, alors que PQ est transformée en plusieurs métabolites actifs hydroxylés par les cytochromes P450 hépatiques, l’activité de PD repose sur son activation au sein de l’érythrocyte parasité et sur ses propriétés de « redox-cycler». L’existence possible d’autres cibles protéiques pour ces deux antipaludiques reste également une question ouverte. Pour étudier ces mécanismes d’action complexes, notre projet s’appuie sur une approche trans-disciplinaire combinant chimie de synthèse, chimio-protéomique, biochimie, biologie cellulaire, et génétique et mettant en parallèle un modèle, la levure S. cerevisiae, et le parasite Plasmodium, qui seront utilisés de manière parallèle. Nos objectifs principaux sont les suivants: 1) mesurer les dommages oxydatifs induits par PD et PQ, 2) identifier les protéines cibles et les enzymes redox contrôlant la sensibilité et la résistance à PQ/PD chez la levure et Plasmodium, 3) confirmer la contribution de ces protéines candidates à la sensibilité et la résistance à PQ/PD chez Plasmodium. Ces travaux permettront une large exploration et une compréhension des voies biochimiques et des gènes impliqués dans le mode d’action de ces molécules antipaludiques et participeront à leur ciblage dans les stades parasitaires aussi bien sexués et asexués, impliqués dans la physiopathologie et la transmission du paludisme, respectivement.

Clostridium difficile (CD) est la principale cause d’infections nosocomiales intestinales après une antibiothérapie. L’impact des infections à CD (ICD) à l’hôpital est considérable en terme de mortalité, de morbidité mais aussi du cout généré par ces infections. En raison de la nature insatisfaisante des thérapies actuelles pour les ICD, il y a un besoin urgent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant les étapes clés des ICD pour faciliter le développement de stratégies ciblant certaines étapes de l'infection pour développer de nouvelles thérapies préventives et/ou curatives. Notre but est de déterminer le rôle de PrkC, une Ser/Thr kinase dans l’homéostasie de l’enveloppe et la colonisation de l’hôte. Nous avons déjà montré que PrkC contrôle les premières étapes du cycle infectieux comme la germination des spores, la résistance à des antibiotiques favorisant les ICD comme les céphalosporines, aux peptides antimicrobiens, une des premières lignes de défense de l’hôte et aux sels biliaires qui sont toxiques pour les cellules végétatives. Les mécanismes de résistance de CD à ses composés restent peu caractérisés. Nous allons dans un premier temps identifier les composants de l’enveloppe (pepdidoglycane et/ou polysaccharides) touchés dans leur abondance ou leur structure lorsque PrkC est inactivé. Pour déterminer l’implication dans la fonction de PrkC des 2 domaines PASTA et du motif atypique présent en C-terminal spécifique à PrkC de CD, nous étudierons leur rôle en utilisant des formes tronquées de PrkC. Afin d’identifier des substrats de PrkC, nous utiliserons ensuite une approche de type phosphoprotéomique combinée avec une stratégie génétique d’isolement et d’identification par un séquençage de nouvelle génération de suppresseurs de la mutation prkC qui restaurent la résistance aux composés antimicrobiens. PrkC et certains substrats d’intérêt seront analysés par des approches de biologie moléculaire, de génétique et de biochimie pour comprendre le rôle physiologique de cette kinase et de ses cibles dans le contrôle de l’homéostasie de l’enveloppe et de la résistance aux composés antimicrobiens. Pour déterminer le rôle de PrkC et de ses substrats dans la colonisation du tube digestif et l’adhésion aux cellules intestinales, nous réaliserons des tests d’adhésion sur des cellules épithéliales puis nous utiliserons des modèles animaux adaptés. Afin de définir la conséquence de chaque événement de phosphorylation dans la physiologie de CD, des souches portant des mutations phosphoabblatives ou des mutations phosphomimétiques au site de phosphorylation de chaque cible seront construites et leur phénotype analysé. En conclusion, nous espérons déterminer quels sont les substrats de PrkC et quelles sont les conséquences physiologiques de leur phosphorylation. DifKin pourrait permettre d’obtenir une vision assez complète du réseau kinase-substrats, de déterminer le rôle régulateur de PrkC dans le contrôle de la résistance à des composés antimicrobiens et des ICD. Ce projet pourrait aussi déboucher sur des nouvelles stratégies de combat contre ce pathogène majeur.

La communauté microbienne dans le tractus gastro-intestinal humain est fondamentale pour la santé et la nutrition de l’hôte. La perte de l’équilibre fragile de cet écosystème complexe, nommé dysbiose, est impliquée dans de nombreuses pathologies, incluant les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI). Les MICI sont causées par la combinaison d’une prédisposition génétique, d’une dysbiose du microbiote intestinal et de facteurs d’environnement. Une meilleure compréhension des interactions entre gènes, microbiote et environnement st donc d’une importance majeures pour proposer de nouvelles stratégies de prévention ou de traitement. Caspase recruitment domain 9 (CARD9), un des nombreux gènes de susceptibilité aux MICI, code pour une protéine adaptatrice qui intègre les signaux en aval de récepteurs de l’immunité innée. CARD9 est particulièrement impliqué dans la réponse immune vis-à-vis des champignons, via une détection par les récepteurs C-type lectin. Nous avons précédemment montré que CARD9 est impliqué dans la restitution après une colite via la production d’IL22, une cytokine ayant des effets bien connus sur l’homéostasie intestinale, et les souris Card9-/- ont une sensibilité accrue à la colite. Dans la suite de cette étude, nous avons récemment montré que la délétion de Card9 avait des effets important sur la composition du microbiote bactérien et fongique et que le transfert du microbiote de souris Card9-/- microbiota vers des souris axéniques génétiquement normales était suffisant pour transmettre le défaut d’activation de l’IL22 et la sensibilité accrue à la colite observée chez les souris Card9-/-. Ce défaut était lié l’incapacité du microbiote de souris Card9-/- à métaboliser le tryptophane en ligands du recepteur aryl hydrocarbon receptor (AhR), comme les dérivés indoles. En fait, des données récentes suggèrent que les catabolites microbiens du tryptophane jouet un rôle dans la réponse immune muqueuse via AhR, qui module la production d’IL22 en retour. Chez l’homme, des mécanismes comparables semblent exister car nous avons montré que le microbiote de patients atteints de MICI présente une production altérée de ligands AhR, corrélé avec le génotype CARD9. Les objectifs du présent projet sont de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la modulation du microbiote par Card9 et d’évaluer le potentiel comme biomarqueur de l’activité agoniste AhR fécale au cours des MICI. Pour cela nous utiliserons des animaux gnotoxeniques, la technologie cre-lox, des approches transcriptomiques, métabolomiques et de séquençage haut débit, ainsi qu’une cohorte de patients atteints de MICI bien phénotypée. Pour atteindre ces objectifs, un partenariat national a été construit entre quate partenaires académiques impliquant trois institutions : INSERM, INRA et Université Pierre et Marie Curie. Nous avons établis une approche intégrée allant de la souris à l’homme et s’appuyant sur des technologies de pointe. Les taches principales du projet sont: (Tache 1) identifier les types cellulaires impliqués dans les effets de Card9 sur la capacité du microbiote à produire des agonistes AhR; (Tache 2) identifier les effecteurs de Card9 impliqués dans le phénotype des souris Card9-/- ; (Tache 3) évaluer la relevance chez l’homme au cours des MICI. Ces résultats apporteront une meilleure compréhension du dialogue hôte-microbiote en situation physiologiques et pathologiques. Plus spécifiquement, nous nous attendons à identifier (i) de nouveaux moyens de moduler le microbiote intestinal et sa capacité à produire des agonistes AhR, (ii) des microorganismes et des métabolites microbiens activant AhR, et (iii) de nouveaux biomarqueurs pronostiques dans les MICI. Globalement, ce projet aboutira à la mise en évidence de nouvelles stratégies thérapeutiques et de monitoring dans les MICI avec un impact potentiel dans les nombreuses autres pathologies impliquant une dysbiose.

Les infections bactériennes post-grippales contribuent fortement au tableau clinique des patients. Les traitements actuels manquent d’efficacité et la résistance aux antibiotiques est un problème majeur. Il est donc urgent de proposer de nouvelles thérapies innovantes. L’altération des mécanismes innés de défense immunitaire favorise la susceptibilité à l’infection bactérienne secondaire. Nous proposons que les désordres intestinaux au cours de la grippe sévère contribuent à l’altération des mécanismes de défense pulmonaire. Cette hypothèse repose sur des données solides et convergentes montrant que la grippe (souris) conduit à une inflammation intestinale et altère la composition et l’activité métabolique du microbiote intestinal, qui est connu pour jouer un rôle dans la réponse immune. Ces changements sont assez sévères pour induire une susceptibilité accrue à l’infection bactérienne pulmonaire comme le montrent nos expériences préliminaires de transfert de flore fécale. Notre projet a l’ambition de mieux cerner les relations poumon/intestin au cours de la grippe chez la souris et le primate non-humain et de restaurer les mécanismes de défense en manipulant le microbiote intestin. Notre défi est de décrire, comprendre et manipuler la physiologie intestinale pour favoriser la défense pulmonaire. Nous procéderons en 4 étapes. Nous définirons plus précisément la nature des désordres intestinaux, qui incluent inflammation, fonction de barrière et composition/activité métabolique du microbiote, au cours de la grippe sévère. Nous combinerons deux modèles expérimentaux : la souris et le macaque, qui représente un très bon modèle pour étudier la physiopathologie de la grippe. Les conséquences de la grippe sévère sur la myélopoièse (moelle osseuse) seront examinées. Nous combinerons des analyses ciblées, des approches non-biaisées (métabolomique) et des analyses multiparamétriques afin d’identifier les mécanismes conduisant aux désordres intestinaux et des marqueurs prédictifs de susceptibilité aux surinfections bactériennes. Nous déterminerons le lien causal entre l’inflammation pulmonaire due à la grippe, les désordres intestinaux et les perturbations de la myélopoièse. Afin de corréler la sévérité de l’inflammation pulmonaire aux désordres intestinaux et la myélopoièse, des anticorps (déplétion cellulaire) capables de réduire la pneumonie seront utilisés. Nous étudierons également la possibilité que la perte d’appétit, qui est l’une des caractéristiques de la grippe, a un impact sur la pathologie. Dans ces conditions (réduction de la pneumonie et de l’apport nutritionnel), la composition/activité métabolique du microbiote, l’homéostasie/barrière intestinale et la myélopoièse seront étudiées. Nous déterminerons les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels le microbiote intestinal altère la réponse immunitaire dans le poumon. Chez les souris colonisées (souris axéniques ou souris conventionnelles préalablement traitées aux antibiotiques), la myélopoièse et la fonction des cellules immunitaires pulmonaires seront déterminées au cours de l’infection par Streptococcus pneumoniae. Nous proposerons différentes stratégies afin de restaurer les mécanismes de défense pulmonaire au cours de la grippe sévère (souris). Le traitement à l’aide d’anticorps (réduction de l’inflammation) ainsi que des régimes riches en fibres et des probiotiques seront proposés afin de restaurer les perturbations microbiennes intestinales et de stimuler l’activité du microbiote. Chez les animaux traités, le profil bactérien, la myélopoièse et la capacité de défense contre l’infection par S. pneumoniae seront étudiés. Ce projet donnera de nouvelles informations sur l’axe poumon/intestin et pourrait conduire à la découverte de marqueurs prédictifs des surinfections bactériennes post-grippales. Il pourrait aussi aboutir à la mise en place de stratégies interventionnelles afin de contrôler ces surinfections.

Les dispositifs optiques pour stimuler et imager l'activité neuronale ont permis récemment des avancées significatives en neurophysiologie vers la compréhension du fonctionnement du cerveau. Les outils moléculaires, tels les activateurs optogénétiques, les sondes d'imagerie calciques, associés aux techniques de microscopie avancées ont permis la manipulation et une lecture ‘tout-optique’ des circuits neuronaux. Cependant, des défis importants restent à surmonter pour un contrôle neuronal optique complet: une expression fiable des capteurs/activateurs dans un même neurone, l'élimination de la diaphonie entre les canaux d'imagerie et d’activation et une précision à l’échelle du neurone et du potentiel d’action uniques. SLALLOM est un projet ambitieux visant à relever ces défis. Il intègre 2 équipes universitaires (Wavefront-Engineering Microscopy group, WEM, du Laboratoire de Neurophotonique et le groupe Lasers du Laboratoire Charles Fabry, LCF) et 2 partenaires industriels (Amplitude Systemes, AS et ALPhANOV). L'idée principale de SLALLOM est de développer un nouveau microscope tout-optique à excitation holographique (Computer-Generated Holography, CGH) et à imagerie 2-photons, les deux en trois-dimensions (3D), utilisant un laser femtosecond (fs) unique à double sortie, une pour l’excitation multicellulaire 3D et une pour l’imagerie 3D. Le laser développé dans SLALLOM représente une rupture technologique visant à remplacer les lasers actuels utilisés en imagerie et photoactivation à 2-photons pour l’optogénétique. En effet, ces lasers (e.g. les lasers Ti:Sapphire, ou les lasers à fibre dopées Ytterbium) souffrent d'inconvénients majeurs: manque d'énergie ou de puissance, trop faible cadence ou longueurs d'onde d'excitation hors des pics d'absorption des outils moléculaires à 2 photons. Ces inconvénients représentent un frein à la parallélisation massive de la manipulation neuronale. Nous proposons un nouveau paradigme pour ce type d’applications avec un laser fs à double-sortie, auto-synchrone, efficace, fonctionnant dans la gamme de longueurs d'onde optimale 920-975 nm. La source utilisera la conversion en fréquence de deux lignes amplificatrices à base de fibres dopées Thulium, injectées par un oscillateur Erbium (lui-même décalé en fréquence). Les paramètres des deux lignes seront optimisés pour leurs objectifs respectifs: l’imagerie (> 5 W, 40 MHz et 100 fs) et la photoactivation (> 5 W, 10 µJ et 100 fs). Le microscope 3D-CGH sera optimisé pour adresser un champ d'excitation large. Il intégrera un système de balayage pour l'imagerie fonctionnelle 3D de l'activité neuronale. La diaphonie sera supprimée en exploitant la supériorité en résolution temporelle du CGH en l’associant à des opsines à cinétique rapides. Ce microscope sera utilisé pour suivre in vivo la complexité du cerveau au niveau du cortex visuel en haute résolution spatio-temporelle. Ce projet, piloté par le groupe WEM, implique quatre partenaires dont l'expertise est reconnue au niveau international. Le groupe WEM est précurseur depuis plus de 10 ans dans le façonnage spatio-temporelle de la lumière par CGH et la focalisation temporelle, comme moyen de ciblage de haute précision spatio-temporelle et parallélisé à de groupes de cellules. Le LCF est largement reconnu comme un acteur majeur de la recherche sur les lasers ultra-rapides pompés par diode appliqués à l’imagerie biologique. ALPhANOV est un centre technologique de renommée internationale spécialiste du développement de lasers à fibre innovants en régimes de fonctionnements extrêmes. AS est la société leader mondial dans la production de systèmes laser fs intégrés de haute qualité industrielle et collabore depuis plus de 10 ans avec le LCF à travers un laboratoire commun. Le consortium SLALLOM démontrera une source laser fs fiable, adaptée au microscope 3D-CGH pour étudier l'activité cérébrale in vivo avec une haute résolution spatio-temporelle et des résultats scientifiques et industriels inégalés.

Les organismes eucaryotes vivent dans un environnement peuplé de microorganismes dont la plupart sont inoffensifs. Cependant, comme certains sont pathogènes et constituent une menace pour l'intégrité de l'hôte, les animaux sont dotés d'un système immunitaire qui détecte et élimine l'agent infectieux. En complément des stratégies d'éradication directe de l'agent causal de l’infection, les animaux adoptent des comportements, regroupés sous le terme générique d'immunité comportementale, visant à réduire l'impact de l'infection sur eux mêmes et/ou sur leur descendance. Alors que les mécanismes moléculaires de détection et d'élimination des microorganismes par le système immunitaire sont connus avec une grande précision, les médiateurs et effecteurs de l'immunité comportementale demeurent largement ignorés. Dans ce projet, nous nous focalisons sur les effets d'un composant bactérien, appelée peptidoglycane (PGN), sur le système nerveux de l'hôte. Chez les vertébrés comme chez les invertébrés, la détection du PGN bactérien par les cellules du système immunitaire, déclenche la production de molécules antibactériennes qui combattent les bactéries infectieuses. Dans une étude récemment publiée, nous avons démontré que certains neurones du système nerveux central de la drosophile ont également la capacité de détecter le PGN bactérien induisant un changement de comportement qui réduit les conséquences de l'infection pour l'hôte (Kurz et al., 2017). Ces neurones qui contrôlent l'oviposition sont octopaminergiques. Ils réduisent la ponte chez les femelles infectées qui adaptent ainsi leur comportement à leur état infectieux. En combinant les expériences d'immuno-marquage et de génétique nous avions identifié les protéines réceptrices du PGN, appelé PGRP (pour PeptidoGlycan Recognition Proteins) qui permettent aux neurones de détecter le PGN et de moduler l'activité des mouches infectées. Nos résultats non publiés montrent que cette protéine est non seulement exprimée par les neurones qui contrôlent l'oviposition mais également dans certains neurones sensoriels externes tels que les sensilles gustatives. Compte tenu de la répartition inattendue (mais sélective) des récepteurs au PGN en dehors des tissus immunitaires, il est possible que la détection du PGN bactérien par les neurones contrôle d'autre comportements que la ponte comme par exemple l'alimentation. Notre proposition qui s'appuie sur la puissance de la génétique de la drosophile a pour but de disséquer au niveau moléculaire, les mécanismes par lesquels les neurones détectent le PGN et comment cette interaction déclenche des changements de comportement de l'hôte. Plus précisément, cette proposition vise à (1) disséquer les mécanismes par lesquels le PGN module l'activité des neurones octopaminergiques (2) examiner la portée générale de cette « immunocompétence » neuronale en mettant l'accent sur le système gustatif périphérique. Des travaux récents conduits chez la souris montrent que le PGN produit par les bactéries du microbiote intestinal est transporté dans le cerveau et que des souris mutantes pour une protéine PGRP présentent des troubles du comportement social (Arentsen et al., 2017). Ces résultats suggèrent que les mécanismes que nous proposons d'élucider entre bactéries et système nerveux de la drosophile pourraient également exister chez les mammifères.

Ce projet vise à décrypter la fonction de groupes de neurones génétiquement définis dans le système nerveux central, avec des outils de pointe qui sont de plus en plus appliqués pour interroger les bases neuronales des comportements. Plus précisément, il explorera des neurones du tronc cérébral et de la moelle épinière dans le contrôle moteur. Le projet prend source dans mes travaux antérieurs sur le comportement locomoteur et son contrôle descendant. Nous nous concentrerons en particulier sur une classe génétiquement identifiée de neurones du tronc cérébral qui récapitule la majorité des neurones réticulospinaux glutamatergiques, et a été récemment montré pour arrêter la locomotion, qui peut initier la locomotion, ou qui peut accélérer la respiration. Cela ouvre la voie à une recherche approfondie de la diversité au sein de cette population neuronale et à son articulation avec des rôles mutuellement exclusifs dans l'initiation et la terminaison du comportement de la marche ou avec des contrôles synergiques de la locomotion et de la respiration. La méthodologie emprunte aux données modernes de la biologie du développement pour manipuler des types cellulaires homogènes sur la base de leur histoire commune d'expression de gènes du développement, et utilisera des traçages viraux hautement sélectifs couplés à des activations optogénétiques in vitro et in vivo. Nous effectuerons d'une part une dissection synapse-par-synapse des partenaires présynaptiques de sous-ensembles spatialement confinés et génétiquement définis de neurones réticulospinaux, afin de les replacer dans des contextes comportementaux pertinents à leur mobilisation. Cela permettra d'identifier les structures impliquées dans la planification / la motivation des mouvements. Nous examinerons également la possibilité que les mêmes neurones réticulospinaux qui arrêtent la locomotion puissent co-moduler la respiration, un autre comportement moteur essentiel lié à la locomotion dans les contextes de l’adaptation à l’exercice, de tâches exploratoires et de réponses défensives. Nous allons donc caractériser les neurones interfaçant deux comportements moteurs essentiels et explorer ainsi la fonction multimodale de la formation réticulée du tronc cérébral. Nous explorerons en outre la possibilité que des sous-ensembles spatialement confinés de neurones réticulospinaux ayant une origine génétique commune soient respectivement dédiés à l'initiation et l’arrêt du comportement locomoteur. Cela sera pertinent pour le contrôle descendant du comportement locomoteur et renseignera sur la logique d’assemblage des modules fonctionnels dans la formation réticulée du tronc cérébral. Nous allons enfin révéler l'identité des types cellulaires, dans les circuits exécutifs locomoteurs de la moelle épinière, qui sont directement ciblés par les voies réticulospinales identifiée tout au long du travail. Cela illustrera un aspect essentiel du rôle coopératif du tronc cérébral et de la moelle épinière dans l'élaboration des comportements et constituera une information instrumentale pour remédier aux déséquilibres d’excitabilité du réseau médullaire locomoteur dans des conditions pathologiques ou post-traumatiques.

La maladie rénale chronique (MRC) est une maladie fréquente affectant 10-12% de la population adulte, et 30% au-delà de 70 ans. Les maladies cardiovasculaires (MCV) sont la principale cause de décès chez les patients atteints de MRC dont le risque augmente régulièrement avec la progression de la MRC. La MRC est principalement associée à deux types de maladies cardiovasculaires: l'athérosclérose accélérée et les MCV spécifiques liées à la MRC, dont l'artériosclérose et les anomalies cardiaques telles que l'hypertrophie ventriculaire gauche et la dysfonction diastolique. L'évaluation des risques liés aux maladies cardiovasculaires est actuellement fondée sur le score de Framingham et les facteurs de risque traditionnels qui sous-estiment les complications CV chez les patients avec une MRC. D'autres facteurs liés à la MRC appelés toxines urémiques peuvent améliorer cette prédiction chez ces patients. Cependant, devant la multiplicité des toxines urémiques connues et inconnues, des méthodes globales telles que la protéomique sont nécessaires pour confirmer et explorer cette question. Nous proposons donc de développer et de valider des profils moléculaires pour prédire les complications cardiovasculaires (objectif principal de PROTEOMARK_CKD) et la progression de la MRC vers l’insuffisance rénale terminale (IRT, objectif secondaire) dans la cohorte CKD-REIN. En effet, CKD-REIN est une large étude de cohorte prospective réalisée dans 40 consultations de néphrologie, représentatives au plan national du point de vue de la région et du statut juridique public ou privé des établissements. De juillet 2013 à mars 2016, 3033 patients adultes (> 18 ans) ayant une MRC modérée (stade 3, DFG de 45 à 59 mL/min/1,73 m2) ou avancée (stade 4, DFG de 15 à 44 mL/min/1,73 m2) CKD, ont donné leur consentement pour participer à l'étude et ont été inclus lors d'une visite de routine. Chez ces patients, les événements cliniques et les décès seront collectés depuis l’inclusion et jusqu'au 31 décembre 2018. À cette date, presque tous les patients auront eu un suivi de 3 ans. Le codage primaire des événements cliniques et des décès pris en compte dans ce projet sera effectué par un médecin qui veillera à ce que les événements CV soient suffisamment documentés pour être adjudiqués. Les échantillons biologiques nécessaires à l’analyse des protéomes urinaires et plasmatiques sont disponibles dans une biobanque. Nous utiliserons une étude de type cas- cohorte (case-cohort design) pour sélectionner les participants à l'analyse du protéome urinaire. Dans ce type d’étude, tous les cas incidents de MCV et d’IRT survenus entre le début de l’étude et le 31 décembre 2018 sont inclus, ainsi qu’un échantillon aléatoire de la population totale au départ. Le consortium se compose de deux équipes (INSERM-U1018 et INSERM-U1048) qui forment les piliers du projet et qui sont clairement complémentaires en termes de capacité opérationnelle et d'expertise clinique (Ziad Massy), épidémiologique et statistique (Bénédicte Stengel et Marie Metzger), en protéomique clinique (Joost Schanstra) et bioinformatique (Julie Klein). Le projet identifiera et validera des signatures moléculaires qui permettront de stratifier les patients atteints de MRC à risque de complications CV (ou de progression vers l’IRT) en combinant les évènements cliniques identifiés avec des profils protéomiques dérivés du plasma et de l'urine, reflétant les processus pathogènes sous-jacents. Le présent projet améliorera de façon significative notre compréhension des mécanismes de la MCV associée à la MRC. La validation des facteurs liés à la MRC peut conduire à la découverte de nouvelles voies physiopathologiques et à une approche pharmacophénomique, associant des stratégies de traitement guidées par des biomarqueurs et des traitements pharmacologiques ciblés à l’échelle individuelle, permettant de réaliser des études interventionnelles chez des patients à risque de MCV ou de progression vers l’IRT.

Avec 30 à 40% de la population mondiale concernée, les maladies allergiques constituent un problème majeur de santé publique. La dermatite atopique (DA) est la manifestation allergique la plus précoce et la plus fréquente (prévalence de 20%). Elle est souvent associée ou suivie par une allergie alimentaire (AA), auxquels succèdent ensuite la rhinite allergique et/ou l’asthme. La «marche atopique» (MA) décrit ce développement séquentiel des maladies allergiques au cours de l'enfance. La physiopathologie de la MA n'est pas entièrement élucidée et il n'existe pas à ce jour de stratégie préventive efficace et validée. La DA est une maladie multifactorielle due à l'interaction complexe de facteurs génétiques et environnementaux. Elle est associée à un dysfonctionnement du système immunitaire (SI) et à une diminution de la diversité du microbiote intestinal chez les nouveau-nés. Ce point suggère l’intérêt des prébiotiques au début de la vie pour induire une composition et une fonction optimale du microbiote intestinal et ainsi prévenir dès sa phase d’initiation la MA et à court terme les manifestations allergiques. A ce titre, la grossesse pourrait constituer une fenêtre d'intervention optimale en agissant sur la maturation du SI et la composition du microbiote in utero puis dans les premiers jours de vie. Nous avons déjà montré dans une étude préclinique une réduction de l’AA après exposition des mères à des prébiotiques pendant la grossesse et l'allaitement. Au second semestre 2017, nous débuterons la 1ère étude clinique dans le monde évaluant l’effet des prébiotiques administrés à des mères en période gestationnelle sur la survenue de DA chez les enfants à risque (PREGRALL). Financée par le PHRC-I, PREGRALL est un essai multicentre contrôlé en double aveugle. Nous recruterons 376 femmes enceintes, à risque d'avoir un enfant atopique. Les participantes seront tirées au sort pour recevoir soit une supplémentation en prébiotiques (GOS/inuline) soit un placebo, sur une période allant de 20 semaines d’aménorrhée à l’accouchement. Le critère de jugement principal est la prévalence de la DA chez l’enfant à un an. PREGRALL donne l’opportunité unique de réaliser une étude ancillaire, CIMMAP, qui fait l'objet de cette demande ANR. CIMMAP a pour objectifs d’améliorer la compréhension de la physiopathologie de la DA et de la MA, d’identifier des biomarqueurs précoces de l’allergie et de caractériser les mécanismes de prévention des maladies allergiques par une intervention nutritionnelle prénatale. CIMMAP utilisera des échantillons biologiques sur au moins 60 dyades mère-enfant (n=30 par bras) inclues dans PREGRALL (sang et selles des mères et des nourrissons, sang de cordon, colostrum et lait maternel) et permettra de caractériser : 1) l’état d’activation et la maturation du SI de la mère et du nouveau-né, via l’exploration de la réactivité/fonctionnalité des cellules innées et des cellules de l’immunité adaptative; 2) la modulation du SI du nourrisson par le microbiote intestinal maternel et ses produits dérivés; 3) les composition et fonction des microbiotes maternel et du nouveau-né; 4) la composition du lait maternel (facteurs immunitaires et de croissance, nutriments et miRNA) et son impact sur les facteurs immuns et microbiens du nouveau-né; 5) les effets potentiels des prébiotiques sur le SI, le microbiote et le lait maternel. Un modèle préclinique de sensibilisation par voie cutanée, reproduisant les symptômes cliniques de la DA associée à l’AA, étudiera en parallèle les mécanismes de la MA et des effets des prébiotiques. Corrélés à la clinique, nos résultats devraient permettre d’identifier les biomarqueurs immunologiques, physiologiques et microbiens associée à l‘allergie et à l'effet des prébiotiques. CIMMAP devrait améliorer la compréhension de la survenue des pathologies allergiques et ouvrir des perspectives d’application industrielle et de développement d’aliments enrichis en prébiotiques afin de prévenir des allergies.

L'objectif de ce projet est de développer un nouveau traitement de l'insuffisance cardiaque sévère fondé sur l'administration contrôlée, par l'intermédiaire d'un biomatériau, des vésicules extra-cellulaires (VEC) sécrétées par des cellules progénitrices cardio-vasculaires. Le rationnel sous-jacent est que le bénéfice des cellules souches transplantées dans le myocarde ne procède pas de leur intégration structurelle mais plutôt de la libération de facteurs activant des voies de réparation endogènes et regroupés dans ces VEC dont le contenu biologiquement actif (acides nucléiques non codants, protéines, lipides) serait ainsi transféré dans les cellules cibles. Plusieurs études expérimentales ont montré dans des pathologies diverses (cardiaque, vasculaire, rénale, rétinienne, cérébrale) que les effets protecteurs des cellules souches pouvaient être largement, voire totalement, récapitulés par la seule administration des VEC qui en sont dérivées. L’utilisation thérapeutique des VEC suscite donc actuellement un intérêt croissant en raison de leurs avantages sur la transplantation de cellules (possibilité d'une production à grande échelle, d'une caractérisation précise et d'une disponibilité immédiate) qui les rapprochent d'un modèle pharmaceutique, ce qui pourrait se traduire par une diminution des coûts de production et une plus grande dissémination de la technique. Notre groupe a montré, sur un modèle murin d’insuffisance cardiaque chronique post-infarctus, que le bénéfice fonctionnel de progéniteurs cardio-vasculaires dérivés de cellules souches embryonnaires humaines - identiques à ceux qui font l’objet d’un essai clinique en cours – était dupliqué par la seule administration des VEC qui en sont dérivées. Nous avons ensuite reproduit ces résultats avec des VEC issues de progéniteurs cardio-vasculaires dérivés de cellules adultes induites à la pluripotence [iPSC]. Ces iPSC constitueront, dans ce projet, la source des progéniteurs cardio-vasculaires, le risque oncologique n'étant plus pertinent puisque les cellules ne sont pas greffées et servent seulement à produire les vésicules in vitro,. Ce projet comporte 3 tâches: (1) l’expansion à grande échelle des progéniteurs cardio-vasculaires dans un bioréacteur; (2) l’isolement des VEC du milieu conditionné par filtration tangentielle avec une membrane permettant de retenir la fraction la plus efficace fonctionnellement, telles que peuvent l’évaluer des tests in vitro de viabilité et d’angiogenèse que nous avons mis au point; et (3) la fonctionnalisation d’un polymère par les VEC purifiées. Notre premier choix est l'acide hyaluronique dont il a été montré qu'il était un vecteur efficace de cellules ou de gènes. L'objectif final est de constituer une banque de VEC et de la qualifier sur les critères habituels (identité, pureté, efficacité, stérilité) avec fonctionnalisation secondaire de l'hydrogel par ces vésicules afin de permettre leur libération contrôlée après administration (par cathéterisme ou chirurgicale) dans le tissu cible. Les études précliniques (cellules et VEC), in vitro et in vivo, seront menées dans notre laboratoire (UMR 970); l’Unité INSERM U1008 (Facultés de Pharmacie, Médecine et Chirurgie Dentaire de Lille) et les équipes « Ingénierie particulaire et cellulaire à visée thérapeutique » et « Physique pharmaceutique » de l’UMR CNRS8612 (Institut Galien Paris-Sud) seront en charge de la mise au point du biomatériau vecteur et de l'optimisation de la libération contrôlée des VEC. La production finale se fera dans des conditions conformes aux Bonnes Pratiques de Fabrication sur la plateforme du Département de Biothérapies Cellulaires et Tissulaires de l’Hôpital Saint-Louis. Le consortium est ainsi conçu pour combiner des expertises complémentaires en cardiologie/chirurgie cardiaque, biologie cellulaire, science des matériaux, études expérimentales et production de lots cliniques de produits biologiques afin de réunir les meilleures conditions d’un succès final.

Les modèles cellulaires de maladies neurodégénératives développés à partir de cellules souches humaines pluripotentes induites (iPS) ont la capacité de reproduire les processus cellulaires et moléculaires conduisant à la maladie. Concernant les maladies de la rétine, la technologie des cellules iPS est particulièrement intéressante pour les maladies dégénératives héréditaires telles les rétinites pigmentaires (RP) qui affectent plus d'un million et demi de personnes à travers le monde. Bien que certains modèles rongeurs de RP puissent être utilisés pour étudier certains aspects de la pathologie de la maladie, leurs rétines ne possèdent pas toutes les caractéristiques d’une rétine humaine et ne reproduisent pas forcément tous les signes cliniques de la maladie. Ainsi les cellules rétiniennes issues de cellules iPS des patients atteints de RP peuvent être utilisées pour comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires liés à des mutations spécifiques. Nous avons généré des lignées de cellules iPS d’une forme spécifique de rétinite pigmentaire (RP) due à des mutations dans un gène codant pour un facteur d’épissage. Aucun modèle animal ne permet aujourd’hui d’étudier fidèlement la pathogénicité de ce type de dystrophie rétinienne causée par des mutations dans un gène d’expression ubiquitaire. Les lignées de cellules iPS mutées pour PRPF31 devraient nous permettre de déterminer les mécanismes responsables de la dégénérescence rétinienne en lien avec ces mutations. Afin d’identifier le(s) type(s) de cellules rétiniennes touchées, nous étudierons le phénotype des photorécepteurs et des cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien issus de ces cellules iPS porteuses d'une mutation. Nous déterminerons si la présence de transcrits différentiellement exprimés et/ou épissés suite à des mutations dans PRPF31 peut expliquer la maladie. Nous tenterons de corriger le phénotype rétinien par une approche d'edition de gène (ou « gene editing ») menant à une augmentation de l'expression de PRPF31. Ces modèles de cellules iPS sont d’un intérêt majeur pour les études précliniques et la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques (criblage pharmacologique, validation de nouveaux systèmes de thérapie génique...).

La tuberculose est la deuxième maladie infectieuse mortelle après le sida et l'une des dix principales causes de décès dans le monde. L'apparition de souches multirésistantes a compliqué la prise en charge thérapeutique et constitue une grave menace pour le contrôle de la pandémie. Les ß-lactamines ont retrouvé un intérêt pour le traitement de la tuberculose dans la mesure ou la ß-lactamase produite par Mycobacterium tuberculosis (BlaC) est irréversiblement inactivée par le clavulanate. Les cibles des ß-lactamines sont inhabituelles chez M. tuberculosis puisque la dernière étape de la synthèse du peptidoglycane est réalisée par des L,D-transpeptidases (LDT) au lieu des D,D-transpeptidases classiques appartenant à la famille des protéines de liaison à la pénicilline (PLP). Les ß-lactamines de la classe des carbapénèmes sont actives contre les LDTs de M. tuberculosis et l’un d’entre eux, le méropénème, en combinaison avec le clavulanate, s’est avéré efficace dans un essai clinique de phase II. Cependant du fait de leur large spectre antibactérien, l'utilisation des carbapénèmes pour le traitement de la tuberculose présente plusieurs inconvénients incluant des effets indésirables sur la flore commensale conduisant à des infections fongiques opportunistes et à la sélection de ß-lactamases à large spectre chez les entérobactéries. Mycobacterium abscessus, une mycobactérie à croissance rapide, soulève des questions médicales distinctes. Ces dernières années, cette bactérie est devenue un important pathogène opportuniste responsable d’une augmentation de la mortalité chez les patients atteints de mucoviscidose ou de maladies pulmonaires chroniques obstructives. Parmi les carbapénèmes, l’imipénème fait partie du traitement recommandé des infections pulmonaires dues à M. abscessus mais l'efficacité de ce médicament est limitée par l’existence d’une ß-lactamase à large spectre (BlaMab) qui n'est pas inhibée par le clavulanate. Comme pour M. tuberculosis, le peptidoglycane de M. abscessus est principalement formé par les LDTs. Dans ce contexte, nous proposons de développer de nouveaux inhibiteurs des LDTs qui contournerons les problèmes soulevés par les carbapénèmes puisqu'ils seront spécifiques des LDTs, et pour cette raison dépourvus d'activité antibactérienne contre les agents pathogènes non mycobactériens. Ces nouveaux inhibiteurs seront également résistants à l'hydrolyse par les ß-lactamases BlaMab et BlaC afin d'éviter de les associer avec un inhibiteur de ß-lactamase. Le projet est basé sur la synthèse totale d'une nouvelle molécule active sur les LDTs. La structure de cette molécule ne peut pas être divulguée dans ce résumé non-confidentiel car nous n’avons pas encore protégé cette innovation. Trois voies de synthèse pour la post-fonctionnalisation de cette molécule sont proposées pour obtenir une première famille de composés. Nous voulons également développer une deuxième famille de molécules en utilisant une méthodologie de synthèse récente. Dans le consortium MYCWall, les composés chimiques obtenus seront utilisés pour explorer le mécanisme d'inactivation des LDTs et comparer leur efficacité dans l'inactivation de ces enzymes. Nous vérifierons également que nos composés ne sont pas inactivés par les ß-lactamases BlaC et BlaMab, comme c'est le cas pour le composé princeps que nous avons déjà obtenu. Pour aider à la conception rationnelle des inhibiteurs, les composés seront co-cristallisés avec des LDT. L'activité antibactérienne des inhibiteurs sera testée contre M. tuberculosis et M. abscessus in vitro et dans des macrophages humains infectés par ces bactéries. Le projet permettra d’optimiser les structures chimiques des composés pour obtenir des molécules actives sur les mycobactéries et inactives sur les entérobactéries. Au final, le projet MYCWall contribuera au développement de nouvelles thérapeutiques pour le traitement de la tuberculose multirésistante et des infections pulmonaires à M. abscessus.

Glycogen storage disease type III (GSDIII) is a rare (incidence: 1:100000) autosomal recessive disorder resulting from the lack of glycogen debranching enzyme (GDE) deputed to glycogen linearization in different tissues. Although GDE is expressed in all the tissues, the disease manifestation is primarily due to its absence in liver and muscle. In particular, during childhood, the disease is mainly metabolic with frequent sever hypoglycemia. During the adolescence the hypoglycemic episodes becomes less severe and a generalized muscle weakness and cardiomyopathy appear. Cirrhosis and hepatocellular carcinoma (HCC) have been reported in adult GSDIII patients. At present, the only curative treatment for GSDIII is based on the dietary administration of complex carbohydrates during childhood to prevent hypoglycemia and a high protein/high fat diet to reduce cardiomyopathy. Patients affected show a progressive impairment in the muscle function associated with exercise intolerance. The absence of curative treatment for GSDIII and the mono-genic character of the disease provide a strong rationale for the development of a gene replacement strategy for GSDIII proposed in TRACeGSDIII. Extensive experience in clinical trials and in preclinical model of muscle diseases indicates adeno-associated virus (AAV) as the vector of choice for in vivo gene therapy for GSDIII. These vectors efficiently transduce liver and muscle, their production is scalable and compared to other gene therapy vectors they have a relatively low immunogenicity profile. In the last years, animal models of the disease became available. In particular, the mouse model recapitulates the disease manifestation in humans with decreased glycemia and progressive muscle weakness. Molecular analysis performed in different tissues demonstrated the complete absence of GDE and an extensive accumulation of glycogen in different tissues. The mouse model is therefore suitable to develop a gene therapy approach for GSDIII. The major obstacle to the development of an AAV vector-based strategy for GSDIII is that the size of GDE transgene is bigger than the AAV packaging size limit. Dual AAV vectors have been proposed to overcome this size limitation. By using dual AAV vectors expressing GDE, we provided proof of concept of the feasibility of GDE gene replacement in GSDIII mice. In particular, by using dual AAV vectors specific for muscle targeting, we demonstrated a complete rescue of the muscle strength impairment. In addition to that, dual AAV vectors specific for the liver expressed GDE in this organ and rescued the hypoglycemic phenotype. Although promising, data obtained indicated several limitations of this approach. In particular the use of two different dual vector approaches to rescue a single disease is definitely not translationally viable. Additionally a high dose of vector was needed to rescue the disease phenotype in muscle and liver in GSDIII mice. Such a dose, corresponding to 5E13 vg/kg has never been tested in humans and could be possibly associated to uncontrolled immune response against the vector. Finally, the production of AAV vectors for human experimentation at this dose is not sustainable for both economics and production reasons. The optimization of the transgene expression cassette and the capsid to reduce the dose of vector needed to rescue the GSDIII phenotype in muscle and liver are the main aims of this grant proposal. At the same time we aim at the characterization of the metabolic pathways that are impaired in GSDIII to develop novel strategies to enhance therapeutic efficacy of gene transfer for GDE.

Le transfert de gènes représente une opportunité nouvelle de thérapie pour des maladies sans traitement efficace. Une alternative aux virus réside dans l’utilisation de vecteurs synthétiques. L’efficacité de ces derniers reste cependant trop faible pour pouvoir connaître un véritable développement. Les virus utilisent la machinerie cellulaire pour permettre de délivrer une information génétique jusque dans le noyau de cellules d’organes ciblés. S’inspirant des virus, nous proposons de construire des nanoparticules mettant à profit la machinerie cellulaire pour améliorer le transport d’acides nucléiques. Les nanoparticules seront plurifonctionnelles, et permettront d’améliorer le franchissement de l’ensemble des barrières extra et intracellulaires. Nous proposons d’utiliser un nouveau couple polymères cationiques-constructions de plasmide pour permettre la formulation de nanoparticules monoplasmidiques (soit la taille accessible la plus faible), biomimétiques des virus. Leur formulation, selon un nouveau procédé, devra conduire à des structures cœur-couronne, formée d’un cœur ADN et d’une couronne furtivante permettant le ciblage extracellulaire, l’internalisation rapide dans la cellule selon un mécanisme endosomale clathrine dépendant, puis une sortie rapide de l’endosome avant une libération l’ADN dans le cytoplasme. L’ADN assurera alors le ciblage intracellulaire, ainsi qu’une fonction d’amélioration de l’internalisation nucléaire. La construction et l’organisation interne de ces nanoparticules sera étudiée par des techniques de rayonnement (SANS et SAXS aux petits angles, résolu dans le temps), et la pertinence des outils proposés pour l’utilisation des fonctions cellulaires sera évalué indépendamment, puis lors de leur intégration dans la nanoparticule. Les performances de transfert de gènes seront évaluées in vitro puis in vivo, selon différentes voies d’administration, systémique pour le ciblage des hépatocytes, et aérosolisation pour les cellules épithéliales. Les mécanismes de trafic intracellulaire d’une part et la biodistribution d’autre part seront analysés et corrélés aux structures et fonctions des nanoparticules. L’analyse de biomarqueurs sera effectuée durant les tests in vivo de façon à contrôler la tolérance de ces nanoparticules, selon les modes d’administration.

Le TNFa est une cytokine homotrimérique du système immunitaire dont la surproduction est associée à de nombreuses maladies inflammatoires chroniques dont la polyarthrite rhumatoïde (PR). Les médicaments anti-TNFa sur le marché sont des anticorps monoclonaux (infliximab, adalimumab, golimumab et certolizumab) ou des récepteurs solubles du TNFa (etanercept). Ces médicaments biologiques présentent plusieurs inconvénients comme : -une diffusion limitée -un mode d’administration inconfortable (sous-cutané ou intraveineux) -des couts de production et en conséquence de vente élevés -une immunogénicité responsable de résistances au traitement -des effets indésirables comme un risque accru d’infections opportunistes Pour surmonter ces inconvénients, plusieurs programmes de recherche ont identifié des petites molécules inhibitrices du TNFa. En particulier, le SPD304 (identifié en 2005), est une molécule de référence qui inhibe l’activité du TNFa par détrimérisation. Le SPD304 n’a jamais été évalué in vivo en raison d’une forte toxicité et d’une activité modérée. Malgré de nombreux travaux, aucune petite molécule inhibitrice du TNFa active par voie orale n’a été identifiée jusqu’à présent pour un objectif thérapeutique ou pour être radiomarquée en vue d’obtenir un traceur diagnostique de l’inflammation dans la PR. L’objectif global du projet Theranalpha est la conception et l’évaluation in vitro et in vivo d’une petite molécule théranostique inhibitrice du TNFa qui permettrait d’obtenir simultanément : -Un candidat médicament fluoré actif par voie orale caractérisé par un profil ADMET adéquat à une dose thérapeutique et une preuve de concept d’activité chez l’animal dans un modèle représentatif de la PR (arthrite au collagène). -Un candidat médicament diagnostique radiomarqué (18F) actif par voie injectable caractérisé par une preuve de concept en imagerie PET chez l’animal dans un modèle représentatif de la PR (arthrite au collagène). Le projet Théranalpha est basé sur des travaux préliminaires des partenaires du projet qui ont conduit à l’identification de deux petites molécules inhibitrices de l’activité du TNFa in vitro à une concentration dix fois plus faible que le SPD304 ce qui, à notre connaissance, constitue le meilleur résultat sur le sujet à ce jour. Ces deux composés sont construits rationnellement avec un motif pyridine de manière à le marquer par un fluor. Le projet Théranalpha vise à résoudre des besoins médicaux actuels : -produire un médicament anti-TNFa actif par voie orale. Aucun médicament anti-TNFa actuellement sur le marché ou en développement clinique n’est actif par voie orale. Cette voie d’administration permet d’améliorer le confort des patients et d’utiliser le produit plus tôt dans la progression de la maladie. -produire un traceur diagnostique radiomarqué au 18F de manière à : -confirmer le diagnostic clinique de la PR en détectant le TNFa soluble et membranaire -déterminer l’état de progression de la PR en diagnostiquant l’activité inflammatoire dans les articulations -déterminer et prédire la réponse au traitement. En particulier l’évaluation précoce d’une non-réponse au traitement fait sens au regard du coût important des biothérapies. -suivre l’efficacité du traitement en évaluant l’activité inflammatoire avant et pendant le traitement ce qui fait sens au regard des effets secondaires importants des biothérapies

Les plaquettes sont indispensables à la vie en combattant l’hémorragie chez les patients traumatisés sévères ou atteints de cancer ou de leucémie chez qui la maladie ou la chimiothérapie empêche la production de plaquettes. Actuellement seule la transfusion de plaquettes issues de dons de sang permet de remonter le taux de plaquettes chez ces patients. La société PlatOD (Plaquettes à la Demande), issue d’un laboratoire INSERM, développe une technologie de rupture afin de produire des plaquettes ex vivo comme alternative à la transfusion de plaquettes de donneur et pour pallier aux problèmes de pénurie et aux besoins croissants de la population. Le procédé de fabrication des plaquettes par PlatOD repose sur le principe de la formation naturelle des plaquettes dans le flux sanguin, en créant un organe de production de plaquettes sur puce microfluidique. Au cours des 4 dernières années, PlatOD, coordinateur du programme ANR PLASMIS, a mis au point avec les physiciens à l’ESPCI (P4 de TRIMEP) une plate-forme microfluidique dédiée à la production de plaquettes et obtenu des plaquettes en quantité et en qualité améliorée en 2 heures à partir de grandes quantités de cellules [mégacaryocytes (MK)]. Cependant, même si cela représente un grand progrès par rapport aux compétiteurs, le rendement de production (5-40 plaquettes recueillies/MK) reste inférieur au rendement physiologique (400-500/MK). Pour augmenter ce rendement de production et franchir un cap nécessaire à l’application thérapeutique, il est essentiel d’aborder les questions du mécanisme de production en flux. Sept aspects répartis en deux grandes questions sont abordés et appliqués directement dans le but de mesurer leur efficacité sur le rendement de production dans la puce PlatOD. Il s’agit des aspects de l’effet du cisaillement sur les interactions VWF/GPIb comportant 1) l’identification des séquences minimales du VWF pour permettre l’ancrage et l’élongation des MK dans la puce; 2) l’analyse des forces hémodynamiques qui permettent la capture, l’élongation et la fragmentation des MK en plaquettes dans la puce; 3) le développement d’outils et de protocoles d’analyse d’images en caméra rapide et en fluorescence en flux; 4) l’analyse directe en flux de la réorganisation du cytosquelette du MK en élongation. Le second aspect concerne le stress oxydant et la production des espèces réactives de l'oxygène (ROS), des résultats nouveaux ayant été obtenus concernant l’induction de la formation de plaquettes par un déséquilibre de production des ROS. Nous allons donc aussi 5) identifier l’origine intracellulaire des ROS dans les MK matures; 6) étudier l’influence de la modulation limitée des ROS dans l’étape de production des plaquettes et les fonctions des plaquettes produites ex vivo; 7) déterminer le lien entre les ROS et la réorganisation du cytosquelette des MK nécessaires pour la production des plaquettes avec le modèle des souris 2B-VWD. Les résultats ayant produit les effets les plus importants à petite échelle seront pris en compte dans les études faites par PlatOD dans sa puce de production à grande échelle pour réaliser l’intégration des données sur le VWF, les ROS et le cytosquelette, avec comme objectif d’augmenter le rendement d’un nouveau facteur 10 s’approchant ainsi du rendement physiologique. Les tâches scientifiques se feront dans le consortium regroupant 5 des 8 partenaires de PLASMIS. Dans ce projet de recherche biomédicale à fort potentiel d’innovation, les nouvelles connaissances scientifiques en biologie et en physique obtenues seront directement transférées pour lever des verrous technologiques et surmonter les problèmes de rendement de production. Les échanges bidirectionnels entre les équipes travaillant avec de petites quantités de cellules et celle de la start-up en charge de la production à grande échelle, permettront d’accélérer la recherche par la sélection des approches pertinentes pour en confirmer l’intérêt dans son procédé de fabrication.

Le projet Parkington vise à proposer une nouvelle approche de thérapie cellulaire pour le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier pour la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington (MP et MH). Au cours de la dernière décennie, les cellules souches pluripotentes ont fourni un accès sans précédent aux types de cellules humaines. Ceci est particulièrement vrai des neurones du système nerveux central, étant évidemment inaccessibles par biopsie. La possibilité de générer des lignées cellulaires isogéniques spécifiques aux patients, ou des banques de lignées cellulaires de donneurs immunocompatible couvrant presque toute la population mondiale ouvre de nouvelles perspectives pour une thérapie cellulaire personnalisée. Les neurones destinés à remplacer les neurones dysfonctionnels ou mourants étaient issus jusqu'à récemment de fœtus avortés ou de lignées de cellules dérivées de carcinome embryonnaire. Aucune de ces sources n’est compatible avec une thérapie cellulaire à grande échelle. La disponibilité de lignées de cellules souches humaines pluripotentes associées au développement de protocoles très efficaces générant des cellules neuronales spécifiques in vitro une variété constitue une étape importante pour surmonter les problèmes éthiques et logistiques susmentionnés. Cependant, en plus de la source cellulaire, il existe une autre limitation empêche la greffe neuronale humaine d’être la stratégie poursuivie par les essais cliniques. La greffe de neurones matures conduit à un taux de survie médiocre en raison de leur sensibilité au détachement et de la fragilité des extensions neuritiques. Une alternative consiste à greffer des précurseurs neuronaux avec l'espoir d'une maturation appropriée in situ. Bien que cette méthode soit largement plebiscitée, elle ne permet pas un bon contrôle de l'identité neuronale in situ et comporte un risque tumoral. Dans le projet de Parkington, nous proposons que la greffe d'organoïdes neuronaux de taille et de contenu cellulaire contrôlé pourrait contourner cette limitation. P # 1 (E. Bezard) est un expert reconnu dans la recherche translationnelle sur les maladies neurodégénératives et dirige une équipe qui se focalise sur la maladie de Parkinson. Le consortium interdisciplinaire construit par P # 1 est composé de 3 autres groupes complémentaires. L'équipe de biophysique de P # 2 (P. Nassoy) a développé la Technologie de Capsules Cellulaires (TCC). La TCC permet l'encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines dans des capsules d'hydrogel creuses et la production de tissus neuronaux de taille contrôlée. L'équipe de P # 3 (A. Perrier) a développé des protocoles pour générer à la fois les neurones dopaminergiques nigraux perdus dans la MP et des neurones GABAergiques striataux perdus dans la MH à partir de cellules souches pluripotentes humaines. L'équipe de P # 4 (A. Gaillard) a démontré que les cellules neurales greffées peuvent récapituler leurs connections physiologiques, en particulier dans le contexte de la reconstruction de la voie nigro-striée dans la MP. Les données préliminaires obtenues grâce à un travail collaboratif local entre P # 1 et P # 2 ont posé les bases du projet. La validation de notre approche jusqu'à un stade préclinique implique des efforts synergiques entre tous les partenaires pour générer et caractériser les "Organoïdes Neuronaux Contrôlés" (ONCs) et évaluer les résultats comportementaux de la greffe d’ONC. Nous sommes convaincus que ce projet démontrera le potentiel de cette approche dans les modèles animaux de la MP et la MH. Cela favorisera l’application de cette technologie dans des études précliniques et ultimement la thérapie cellulaire humaine. Le projet Parkington a pour ambition de proposer une solution thérapeutique qui soit une véritable alternative au traitement médicamenteux symptomatologique à la fois pour la MP et la MH.

Les peptides amphipathiques riches en histidine, aussi appelés dérivés LAH4, développés et étudiés dans nos laboratoires, présentent une grande variété de fonctions biologiques, qui peuvent être modulées par des modifications subtiles de la séquence, du pH, de la salinité et d’autres paramètres environnementaux. Certains peptides LAH4 sont capables de former des pores membranaires et présentent ainsi une forte activité anti-microbienne, qui est plus prononcée à pH acide lorsque les résidus histidines se retrouvent protonées. De plus, l’auto-assemblage des peptides LAH4 permet la formation de structures globulaires capables de se complexer avec des acides nucléiques ou des protéines, ce qui en fait de très performants agents de transfection, permettant ainsi l’entrée dans la cellule cible de différents types de cargos. Enfin, certains peptides LAH4 sont capables de promouvoir l’entrée de virus ou vecteurs viraux dans la cellule cible (e.g. Vectofusin-1®), ce qui en fait des additifs de choix pour les approches de thérapie génique mettant en jeu des vecteurs adéno-associés (AAV) ou des vecteurs lentiviraux. Dans ce projet, nous allons chercher à comprendre pourquoi de subtiles modifications de séquence dans les peptides LAH4 sont capables d’induire des changements importants dans leurs propriétés biologiques. Sur la base de nos résultats préliminaires, nous avons posé l’hypothèse qu’une simple modification de séquence pouvait modifier en profondeur l’architecture supramoléculaire et donc conduire à des fortes différences en fonctionnalités. Bien qu’ils soient très ressemblants et souvent des isomères, les peptides LAH4 peuvent se trouver sous forme monomérique ou oligomérique (anti-microbien), sous forme de complexes globulaires plus larges, de quelques nano, voire micromètres (transfection) ou sous forme d’agrégats fibrillaires de plusieurs micromètres pouvant conduire à la formation d’un hydrogel (transduction virale). Par conséquent, nous proposons d’examiner de façon systématique comment l’état d’agrégation d’un peptide en solution ou dans les membranes corrèle avec les activités testées dans divers essais anti-microbiens, de transfection ou de transduction virale. De plus, les complexes supramoléculaires de peptides LAH4 seront étudiés par des approches biophysiques très complémentaires comme la microscopie à force atomique, la diffraction aux rayons X et la résonance magnétique nucléaire à l’état solide, incluant la polarisation nucléaire dynamique dans les conditions de rotation à l’angle magique à très haute vitesse (ultra MAS-PND). Les modèles structuraux de haute résolution ainsi obtenus permettront de mieux définir quelles sont les interactions peptides/peptides, peptides/acides nucléiques et peptides/membranes. De cette manière, nous pourrons mieux définir quels résidus d’acides aminés jouent un rôle essentiel dans l’auto-assemblage des peptides en structure supramoléculaire, ouvrant ainsi la voie à la synthèse de nouveau dérivés peptidiques plus performants pour une activité biologique donnée. Comme l’assemblage supramoléculaire dans un environnement aqueux est réversible et aussi dépendant de la concentration en peptide et de l’environnement chimique, une importance toute particulière sera apportée dans la mise en place des études biophysiques afin qu’elles miment au mieux les conditions utilisées en essais biologiques. Grâce à un partenariat industrie/Académie, la RMN solide incluant la ultra MAS-PND sera disponible et plus amplement développée dans le cadre de ce projet. Ce gain en sensibilité offert à la RMN solide permettra l’observation directe d’un noyau 1H, une caractéristique importante pour l’étude des sites de contact intermoléculaires. Pour mettre en place ce projet ambitieux, trois laboratoires académiques et deux industriels formeront un réseau d’experts spécialistes en biophysique, RMN solide, biologie cellulaire et applications biomédicales.

Le projet CLEAR propose des méthodes innovantes pour la création de ressources et d'un prototype informatique dédiés à la simplification des textes médicaux en français. Le prototype a la vocation de jouer le rôle d'intermédiaire dans la communication entre les patients et les médecins. Le projet propose plusieurs points originaux, comme par exemple, orienter les recherches sur les besoins des patients, traiter de grosses masses de données hétérogènes et non structurées, adapter les méthodes de TAL au domaine médical, créer une base avec des connaissances pour l'explicitation de termes médicaux en français. Le projet offrira des ressources pouvant être exploitées par les médecins pour améliorer leurs interactions avec les patients. Pour les patients, il s'agit d'un moyen pour leur faciliter l'accès aux connaissances sur la pathologie et son traitement, afin qu'ils puissent mieux gérer leur pathologie et augmenter le degré de participation à la vie sociale malgré la maladie.

L’activité neuronale repose sur des transferts de charges qui créent des potentiels électriques et des courants. Ces courants émettent des champs magnétiques qu’il est possible de détecter. Les champs magnétiques à basse fréquence ont la propriété de traverser les tissus sans distorsion, permettant ainsi une mesure précise et à distance avec un dispositif présent à l’intérieur d’un système biologique. Nous avons récemment apporté la première preuve de concept, basé sur ce principe, de mesure locale de l’activité de réseaux neuronaux in vivo, à l’aide de magnétrodes, un nouvel instrument utilisant des capteurs magnétiques à base d’électronique de spin pour la mesure du signal magnétique. Afin d’enregistrer à l’échelle neuronale des évènements uniques, nous devons améliorer la sensibilité de ces capteurs et intégrer l’électronique à la sonde. Dans ce projet, nous utiliserons des Magnéto-Résistances Tunnel bas bruit et intégrerons l’électronique de mesure dans le substrat en silicium de la sonde. Ainsi, ce nouveau dispositif de mesure ouvrira le champ de la magnétophysiologie afin de comprendre les mécanismes de la transmission d’information neuronale grâce à une cartographie des courants ioniques dans le neuropile. Il sera possible d’accéder à un contenu vectoriel provenant de plusieurs neurones en simultané, applicable à terme à des implants neuronaux.

Les séquences virales endogènes (EVE) sont des séquences nucléiques d’origine virale qui se sont intégrées dans le génome de leurs hôtes par des mécanismes de transfert de gène horizontal (HGT) passif ou actif. La majorité des EVE connues chez les plantes est issue de virus à génome ADN des familles Caulimoviridae et Geminiviridae. Des partenaires du projet EVENTS ont montré récemment que des séquences appartenant à la famille Caulimoviridae sont présentes dans le génome de nombreuses angiospermes, notamment des espèces cultivées d’importance mondiale (riz, sorgho, oranger, vigne, pommier, poirier, fraisier, eucalyptus, peuplier, tomate, pomme de terre, concombre, coton). Les virus correspondants appartiennent à un nouveau genre viral putatif appelé Florendovirus. Plusieurs florendovirus endogènes sont structuralement capables de réplication, donc potentiellement infectieux ; cependant, aucune forme infectieuse de ces virus n’a jusqu’à présent été identifiée. D’autres partenaires du projet ont découvert dans le génome des ignames des séquences apparentées à des geminivirus (EGV ; famille Geminiviridae), et démontré que des protéines fonctionnelles codées par ces EGV sont synthétisées par les plantes hôtes. Fort de ces avancées, le projet EVENTS vise à élucider le rôle dans l’évolution des virus et les fonctions chez les plantes des EVE Caulimoviridae et Geminiviridae. Dans le cadre de ce projet, des outils de criblage automatique des génomes de plantes seront créés et utilisés pour une recherche à grande échelle de nouvelles EVE qui donneront accès à des séquences virales intégrées il y a plusieurs millions à plusieurs dizaines de millions d’années. Ces EVE serviront à reconstruire l’histoire évolutive de lignées virales sur des pas de temps inédits et à générer des données qui nourriront les modèles prédictifs d’émergence virale. Des outils sérologiques et moléculaires seront créés et utilisés pour étudier la contribution à la diversité des virus des EVE Caulimoviridae et Geminiviridae. Ils serviront à rechercher des particules virales et des génomes viraux infectieux d’espèces virales geminivirus et florendovirus dont des EVE sont présentes dans le génome de plantes. Leur nature infectieuse sera confirmée par des expériences de greffage sur des plantes indicatrices. Le rôle du silencing dans la régulation de l’expression des EVE sera également abordé, en recourant à des systèmes expérimentaux utilisant des EVE et des virus codant des inhibiteurs de silencing. Le rôle des EVE Caulimoviridae et Geminiviridae dans la régulation génétique et épigénétique de l’expression des gènes de plantes fera l’objet d’analyses in silico. Des approches moléculaires et immunologiques seront utilisées pour rechercher des ARN messagers transcrits à partir d’EVE et les protéines virales correspondantes. Enfin, des approches expérimentales utilisant des clones viraux infectieux recombinants seront mises au point et utilisées pour étudier le rôle éventuel dans les mécanismes de défense antivirale des EVE Caulimoviridae, qui pourraient s’apparenter à des transgènes viraux naturels. En mettant au point des approches novatrices, intégrées et multidisciplinaires pour recenser les EVE de plantes et caractériser leur rôle dans l’évolution des virus, leurs fonctions et rôles bénéfiques éventuels pour les plantes, le projet EVENTS se place résolument à la pointe des recherches sur les EVE, qui sont en pleine expansion. Au-delà des avancées scientifiques générées, ce projet apportera une contribution déterminante à des problématiques sociétales particulièrement prégnantes telles que le contrôle des maladies infectieuses d’origine virale et les biotechnologies végétales. Pour y parvenir, le projet rassemble un consortium d’équipes françaises, sud-africaines et australiennes aux expertises complémentaires en virologie, bio-informatique et systématique moléculaire qui collaborent de longue date et ont démontré leur capacité à relever des défis ambitieux.

L'abeille Apis mellifera est le pollinisateur le plus important pour l'agriculture dans le monde. Son service de pollinisation est gravement menacé par les pertes de colonies, qui ont considérablement augmenté récemment. Pour promouvoir et maintenir la santé et la diversité génétique de nos populations d'abeilles, il est crucial de mieux comprendre leurs comportements reproductifs et sociaux. De nombreuses études ont décrit les structures cérébrales impliquées dans la perception et l'apprentissage olfactifs chez l’abeille ainsi que les processus de traitement de l’information olfactive dans son cerveau. Cependant, on connaît peu de choses sur les processus à la périphérie de son système olfactif, au niveau des neurones sensoriels olfactifs logés dans les antennes. Les principaux acteurs moléculaires impliqués dans la détection des odorants sont les récepteurs olfactifs (RO) exprimés à la membrane des neurones sensoriels olfactifs. Alors que le génome de l'abeille a été séquencé il y a 10 ans et que ~ 170 gènes codant pour des RO candidats ont été annotés, seulement 3 RO sont maintenant « déorphanisés » (c'est-à-dire que le ligand olfactif pour ce récepteur a été identifié). Dans le cadre de ce projet, nous allons exprimer des OR individuels dans des systèmes d'expression hétérologues (neurones sensoriels olfactifs de drosophile et ovocytes de xénope) et caractériser leurs spectres de réponse en sélectionnant des odorants pertinents écologiquement. Plus spécifiquement, nous étudierons les RO qui sont surexprimées chez les abeilles mâles et chez les ouvrières, et impliqués respectivement dans l'accouplement et dans les comportements sociaux comme la discrimination des congénères. Le projet propose trois objectifs : L'OBJECTIF 1 traite de la communication sexuelle des abeilles. Nous chercherons à identifier les ligands de trois RO surexprimés chez les mâles et qui détecteraient des phéromones produites par les reines mais aussi les mâles eux-mêmes. Les RO individuels seront exprimées dans des neurones sensoriels olfactifs de drosophile, et l'activation des récepteurs sera évaluée électro-physiologiquement en effectuant un screening d’odorants émis par les reines et les mâles. Nous confirmerons l'activation du cerveau des mâles (macroglomérules) par les ligands candidats grâce à l’imagerie optique in vivo. Leur effet sur le comportement des mâles sera évalué au laboratoire à l'aide d'un compensateur de locomotion et dans les zones de congrégation de mâles en utilisant des appâts chargés d'odeurs. L'OBJECTIF 2 s’intéressera aux interactions sociales. Le génome de l'abeille contient ~ 44 RO du clade à 9-exons, qui sont plus fortement exprimés chez les femelles (ouvrières). On pense qu'ils détectent les hydrocarbures cuticulaires impliqués dans la discrimination des congénères. Nous effectuerons une étude approfondie des RO à 9-exons des abeilles, en développant une méthode de déorphanisation à haut débit basée sur des enregistrements robotisés d'ovocytes de xénope. Des expériences d'apprentissage et de rencontre dyadique (agression) testeront leur implication dans la reconnaissance des congénères. L'OBJECTIF 3 permettra de cartographier le répertoire des RO dans le cerveau de l’abeille. Nous étudierons le codage des ligands principaux et secondaires dans le lobe antennaire en utilisant l'imagerie optique in vivo et notre préparation récente pour accéder aux régions cachées de cette structure. Ensuite, nous utiliserons des techniques d’analyse multidimensionnelle (clustering) sur les spectres de réponse aux odeurs des RO individuels et des glomérules AL identifiés afin de cartographier la représentation des RO dans le lobe antennaire. Les résultats de ce projet stimuleront à la fois la recherche fondamentale et le développement de nouvelles stratégies de protection et de conservation des abeilles, en manipulant leurs comportements sexuels et sociaux.

Le Fer (Fe) est un micronutriment essentiel pour la productivité des plantes ainsi que pour la qualité de leurs produits dérivés. Cependant le Fe est généralement peu disponible pour les plantes car il est principalement présent dans le sol sous forme de chélates insolubles. Nous avons, ainsi que d’autres équipes, récemment identifie´ un nouveau mécanisme qui repose sur la sécrétion dans le sol de coumarines (métabolites secondaires), par le transporteur PDR9, afin d'améliorer la capacité d'extraction du Fe par les plantes. Des études récentes que nous avons réalisées nous indiquent que ce processus de sécrétion de coumarines suit une voie complexe et non encore décrite impliquant plusieurs types cellulaires et l’activité de plusieurs protéines impliquées dans leur transport. La caractérisation de la dynamique du transport de ces coumarines et de leur sécrétion dans le sol constitue donc le prochain défi que nous souhaitons relever. Il s’agit là d’une question essentielle si l'on souhaite améliorer la productivité des espèces cultivées tout en fournissant des aliments de qualité à une population croissante sans apport exogène de fer sous forme d’engrais. En plus d’être onéreux, l’utilisation de ces derniers peut être mise en cause en termes de durabilité dans une agriculture moderne.

Nous cherchons à comprendre et à exploiter le rôle crucial mais encore mal connu des régulateurs du cycle cellulaire de la bactérie symbiotique Sinorhizobium meliloti au cours de la symbiose fixatrice d’azote avec des plantes Légumineuses du genre Medicago. Les plantes légumineuses peuvent établir une relation symbiotique avec des bactéries fixatrices d’azote appelées rhizobia, formant des organes appelés nodosités. Au sein des nodosités, les bactéries sont hébergées et réduisent l’azote en ammonium qui est transféré à la plante. Les bactéries endosymbiotiques, appelées bactéroïdes, adaptent leur métabolisme à la vie intracellulaire et à la fixation symbiotique d’azote. Chez certaines légumineuses, les bactéroïdes subissent une différenciation cellulaire terminale (irréversible) impliquant un fort allongement cellulaire, avec une enveloppe cellulaire fragilisée et une polyploïdie du génome. Ce processus est restreint à certains clades de légumineuses et augmenterait l’efficacité symbiotique et le bénéfice pour la plante. L’augmentation du contenu en ADN des bactéroides implique, lors de leur formation, la modification du cycle cellulaire, qui est une alternance de phases de réplication du génome et de division cellulaire, vers une répétition des phases de réplication sans division cellulaire entre celles-ci. Le partenaire 2 (Mergaert) a montré que les cellules symbiotiques de M. truncatula produisent des centaines de peptides antimicrobiens appelés NCR (pour Nodule specific Cysteine Rich), qui induisent la différenciation terminale des bactéroïdes chez S. meliloti. De manière frappante, l’application du peptide NCR247 sur des bactéries en vie libre permet de reproduire ce processus de différenciation, suggérant que ce peptide cible la machinerie du cycle cellulaire bactérien. De plus, les cellules traitées par NCR247 présentent une forte répression de l’expression des gènes régulés par CtrA, le régulateur maitre du cycle cellulaire. Le partenaire 1 (Biondi) a montré que CtrA contrôle le cycle cellulaire de S. meliloti comme chez Caulobacter crescentus, le système modèle pour l’étude du cycle cellulaire chez les alphaprotéobactéries. Chez C. crescentus et S. meliloti, CtrA réprime la réplication du génome et promeut la division cellulaire, suggérant que le mécanisme de différenciation des bactéroïdes chez S. meliloti passerait par une inhibition de CtrA. En accord avec cette hypothèse, le partenaire 1 a montré que la protéine CtrA chute à des niveaux très bas dans les bactéroïdes et que la déplétion de CtrA dans des cultures de S. meliloti conduit à une phénocopie des bactéroïdes. Chez C. crescentus, CtrA présente une régulation négative complexe, vu qu’elle peut être réprimée par (i) une protéolyse sous le contrôle du cycle cellulaire, (ii) déphosphorylation et (iii) des cofacteurs post traductionnels. Chez S. meliloti, la protéolyse de CtrA joue un rôle crucial dans la progression du cycle cellulaire, suggérant que ce mécanisme puisse également être impliqué dans la différenciation des bactéroïdes. Néanmoins, le lien mécanistique entre les peptides NCR et la régulation du cycle cellulaire bactérien reste nébuleux et sera clarifié au cours de ce projet. Nous proposons une approche multi-échelles pour analyser systématiquement le rôle des facteurs du cycle cellulaire au cours de l’infection symbiotique. Nous utiliserons une combinaison de méthodologies issues de la génétique bactérienne et de la biologie cellulaire pour analyser des bactéries en cultures traitées ou non par des NCR ainsi que des bactéroïdes dans les nodosités. De plus, nous prédisons que la modulation du niveau de CtrA in planta pourrait mener à une augmentation de la différenciation des bactéroïdes chez Medicago voire à une élongation cellulaire dans des plantes ne produisant pas de NCR. Cela pourrait mener à une augmentation de l’efficacité de la fixation d’azote par ces bactéroïdes. Ces hypothèses seront également testées au cours du projet SymbiontCellCyc.

La fleur assure une reproduction efficace des angiospermes et fournit fruits et graines. Le facteur de transcription LEAFY est le régulateur clé du développement des fleurs. Son activité dépend de son interaction physique avec l’ubiquitine ligase UFO, mais la raison de cette dépendance est inconnue. Notre projet vise à élucider comment l’ubiquitination permet à LEAFY d’induire la formation des fleurs. Nous combinerons génomique, imagerie, biologie structurale et protéomique pour comprendre: i) où se produit l’interaction LEAFY-UFO au niveau tissulaire, subcellulaire et génomique, ii) quelles sont les propriétés structurales du complexe et comment il régule l’expression d’un ensemble spécifique de gènes, iii) le rôle de l’ubiquitination. Enfin, nous proposons d’utiliser LFY et UFO pour induire la formation de fleurs à partir de n’importe quel tissu permettant ainsi de modifier à souhait les inflorescences de plante, en s’affranchissant des contraintes d’espèces ou environnementales.

Le scenario actuel du réchauffement climatique prévoit pour les plantes, une augmentation du nombre d’épidémies liées à la multiplication des pathogènes dans de nouvelles zones géographiques. Cette expansion des maladies représente une menace importante pour la production végétale en causant des pertes significatives de rendement. Aussi, l’un des défis majeurs en amélioration des plantes sera de développer des stratégies de lutte efficaces et durables contre ces agents pathogènes. Pour cela, l’identification des processus moléculaires permettant aux plantes de résister à ces agresseurs représente aujourd’hui une piste de recherche cruciale, notamment en vue de développer de nouveaux produits pour la protection des plantes. En conditions naturelles, les plantes doivent faire face, de manière simultanée, à de multiples contraintes qui sont à la fois de nature biotique (bactéries, champignons, virus, insectes) et abiotique (sécheresse, salinité, température). Pour se développer et se reproduire de manière satisfaisante, les plantes doivent mettre en place des stratégies adaptatives. Bien que certains composants génétiques à l’origine des réponses aux contraintes environnementales aient pu être identifiés et caractérisés, nos connaissances actuelles sur les stratégies développées par les plantes en réponse à ces stress combinées (biotiques et abiotiques) restent fragmentaires. Ainsi, des changements environnementaux, tels qu'une augmentation faible mais permanente de la température (3-5°C) suffit à inhiber les principaux mécanismes de défense des plantes à l’égard de pathogènes très variés. Ce projet explorera la contribution de la signalisation calcique dans les processus d’adaptation propres aux plantes. En effet, la plupart des stimuli externes induisent une augmentation rapide de la concentration en calcium au niveau intracellulaire et le calcium est connu pour coordonner de nombreuses réponses adaptatives. Pour cela et afin de relayer cette information vers des protéines effectrices, il est nécessaire de décoder ces variations de calcium. Envisager de manipuler le calcium de manière ciblée pour activer ces réponses adaptatives reste une approche risquée au vu des nombreux acteurs impliqués dans l’homéostasie calcique, tandis que, décrypter le rôle des protéines de décodage du calcium et/ou de leurs protéines cibles, constitue un nouveau défi envisageable. L'originalité du projet sera de se concentrer sur une famille de décodeurs calciques spécifiques aux plantes, les CalModulin-Like (CMLs). Bien que leurs rôles respectifs restent encore à déterminer pour la majorité d’entre elles, plusieurs exemples montrent leur implication dans les réponses à des stress biotiques et abiotiques justifiant le projet envisagé. L’analyse fonctionnelle des CMLs reste encore une thématique émergente dans le domaine de la signalisation chez les plantes et notre but sera de démontrer, à l’aide d’outils génétiques, que les CMLs peuvent être des intégrateurs des réponses biotiques et abiotiques. Le projet sera développé sur deux plantes modèles: Arabidopsis thaliana et la tomate (Solanum lycopersicum). Nous considérerons comme stress abiotique l'impact d’augmentations faibles mais permanentes de la température (+3 à +5°C) sur l'interaction de ces deux plantes modèles avec deux des bactéries pathogènes les plus importantes à l’échelle mondiale, Ralstonia solanacearum (Rs) et Pseudomonas syringae pv. Tomato (Pst). La tomate a été retenue comme plante modèle dans les études d'interaction entre plantes et pathogènes parce qu'elle est l’une des espèces les plus cultivées et reste extrêmement sensible à Rs et à Pst. Nos objectifs visent à la caractérisation fonctionnelle de CMLs associées aux stress et impliquées dans la tolérance d’Arabidopsis et de la tomate. Enfin, une attention particulière sera consacrée aux processus moléculaires contrôlés par ces CMLs en identifiant et caractérisant leurs protéines cibles.

Comment le sexe d’une fleur ou d’une plante est contrôlée est une question centrale de la biologie du développement chez les plantes. Comprendre ce processus a également d’importantes implications pratiques en agriculture et en sélection des plantes, dans la mesure où le sexe des fleurs et des plantes constitue souvent un facteur limitant de la sélection et de la production des plantes cultivées. Le déterminisme du sexe est un processus qui aboutit à la séparation physique des structures à l’origine des gamètes mâles et femelles, soit sur des fleurs séparées sur une même plante, pour les espèces monoïques, soit sur des individus séparés, dans le cas des espèces dioïques. Chez les Cucurbitacées, plusieurs espèces dont le melon portent des primordiaux floraux bisexués, qui se développent en fleurs unisexuées. Le type sexuel est déterminé par l’inhibition sélective au cours du développent du primordium à l’origine de l’étamine ou du carpelle. Chez le melon, le déterminisme du sexe est contrôlé par le gène andromonoecious (M), le gène androecious (A) et le gène gynoecious (G). L’interaction des allèles de ces trois gènes conduit à différents types sexuels. Le clonage et la caractérisation des gènes A, G et M nous a permis de proposer un modèle dans lequel les trois gènes interagissent pour contrôler le développement des fleurs mâles, femelles et hermaphrodites. Maintenant que les gènes contrôlant le déterminisme sexuel sont clonés, l’objective est de comprendre comment leurs expression conduit à l’inhibition du développement des organes sexuels. Des résultats récents des partenaires de ce projet montrent que, le développement des types sexuels chez le melon est sous contrôle épigénétique. L’objective de ce projet est d’étudier le rôle de la composante épigénétique dans le déterminisme du sexe. La stratégie proposée repose sur les compétences complémentaires des 3 partenaires du projet et sur l’intégration des données qui seront obtenues par la combinaison de différentes technologies ‘’omiques?. Les hypothèses et les concepts seront validés par une approche génétique. Le but final du projet EPISEX est de produire des prototypes stables de melon pour les différentes formes sexuelles et de tester leur intérêt agronomique. Les résultats et les concepts qui seront obtenus sur le modèle melon seront transférés, à l’issue du projet, à d’autres Cucurbitacées.

Le nitrate (NO3-) est la principale source d’azote (N) pour les plantes herbacées. Il agit aussi comme molécule-signal régulant l’expression de centaines de gènes, dont des acteurs de son assimilation et du métabolisme primaire. Cette Réponse Primaire au Nitrate (PNR) a principalement été étudiée chez Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), permettant l’identification des facteurs de transcription AtNLP6 (NIN-LIKE PROTEIN 6) et AtNLP7 comme régulateurs majeurs (Castaings et al., 2009 ; Konishi and Yanagisawa, 2013). La surexpression de AtNLP7 permet une stimulation de croissance, via une augmentation des assimilation azotées et carbonées (Yu et al., 2016), ce qui identifie les NLPs et la PNR comme leviers pour améliorer l’Efficacité d’Utilisation du N (NUE) afin d’obtenir de forts rendements en faibles apports de N. Le mécanisme de PNR apparaît partiellement conservé chez les autres espèces, malgré l’identification de spécificités chez les céréales (He et al., 2015). Nos résultats préliminaires montrent un rôle des NLPs dans la régulation de la PNR chez les Pooideaes, une sous-famille de monocotylédones qui inclut le blé (Triticum aestivum), l’orge (Hordeum vulgare) et Brachypodium (Brachypodium distachyon). Nous proposons de décrypter la PNR chez les Pooideaes, à partir des NLPs. Une étude de génomique fonctionnelle comparative nous permettra d’acquérir une connaissance fondamentale sur le mécanisme de régulation. Précisément, nous prévoyons d’identifier à grande échelle les gènes et voies ciblés, de mettre en évidence le rôle des NLP et de disséquer la mécanistique moléculaire des NLPs. Par comparaison avec les connaissances acquises chez Arabidopsis, nous estimerons la conservation/divergence du mécanisme entre espèces. Nous avons sélectionné Brachypodium et l’orge comme modèles d’étude, dû à leurs génomes diploïdes séquencés et aux panels de méthodes et de ressources disponibles. L’union Européenne est la première productrice d’orge (40% de la production mondiale), avec la France et l’Allemagne en leaders (18% de la production de l’UE chacune), ce qui valide le choix de cette espèce. Brachypodium est indispensable à l’étude, pour estimer l’évolution entre les monocotylédones et les dicotylédones et la domestication des céréales. Cette espèce de référence permettra aussi l’utilisation de techniques moléculaires de pointe qui seraient plus compliquées chez d’autres Pooideaes, et accélérera le processus de découverte grâce à son cycle de vie court et à sa faible taille. Des orthologues de AtNLP6/7 ont été identifiés chez l’orge et brachypodium (HvNLP1, BdNLP6 et BdNLP7). Nous avons expérimentalement observé un épissage alternatif de BdNLP6/7, qui a également été décrit pour ZmNLP6 (Burdo et al., 2014) et prédit pour HvNLP1. Ce processus tronque le domaine PB1, potentiellement impliqué dans des interactions protéine-protéine et conservé chez tous les NLPs de plantes. Ces protéines alternatives suggèrent une spécificité chez les céréales du mécanisme dépendant des NLPs. La PNR sera caractérisée par transcriptomique comparative entre les 3 espèces, produisant ainsi le premier set de données transcriptomiques sur la PNR chez les Pooideaes. La conservation de fonction entre nos NLPs d’intérêt sera évaluée par analyse de mutants et par complémentations inter-espèces. Puis, leur régulation post-traductionnelle, leurs gènes cibles et le rôle de l’épissage alternatif seront identifiés. Nous sommes à notre connaissance le premier groupe à mener une vaste étude de la PNR et des NLPs chez les Pooideaes. Ce projet JCJC contribuera fortement à l’établissement du jeune coordinateur en tant que leader dans le domaine de la réponse au NO3- chez les céréales, et permettra d’initier des collaborations internationales pour de futurs projets. Les connaissances fondamentales issues de cette étude seront précieuses pour des applications futures.

La tomate est un modèle privilégié pour les espèces à fruits charnus et c’est le légume le plus consommé de part le monde. Malgré les goulots d'étranglement génétiques récurrents qui se sont produits depuis sa domestication, la tomate présente une diversité phénotypique exceptionnelle, qui résulte probablement de la sélection par l’homme d’d'allèles à effets forts. L’origine génétique de cette diversité phénotypique n'est cependant pas claire, compte tenu des goulets d’étranglement populationnels qu’à subi la tomate de façon répétée depuis sa domestication. Relativement aux mutations nucléotidiques ponctuelles ou de petite taille, les insertions d’élements transposables (ET) ont un potentiel beaucoup plus important de générer des allèles à effets forts, notamment parce que ces insertions peuvent perturber profondément l’expression des gènes avoisinants ou encore moduler épigénétiquement celle-ci. Néanmoins, la contribution de la mobilisation des ET ainsi que du contrôle épigénétique qui s’exerce sur eux à la domestication et à l'amélioration de la tomate n'est que très peu connue. Ici, nous proposons d'utiliser de nouvelles approches génomiques pour caractériser globalement le "mobilome" de la tomate cultivée et de ses premières formes (S. lycopersicum var. Cerasiforme) ainsi que de l’espèce sauvage la plus proche S. pimpinellifolium. Cette caractérisation nous permettra de déterminer notamment le rôle des ET dans la variation de l'expression des gènes parmi les accessions. Nos objectifs spécifiques sont les suivants: (I) Déterminer la composition du mobilome de la tomate domestiquée ainsi que de l’espèce sauvage la plus proche (Ii) Caractériser la contribution de la mobilisation des ET à la variation de l'expression génétique lors de la domestication et de l'amélioration de la tomate (Iii) Évaluer la part des variations d'expression des gènes parmi les tomates cultivées qui résulte de la présence/absence d’insertions d’ET ou de l’altération de leur contrôle épigénétique plutôt que de petits changements de la séquence d'ADN. L'objectif 1 repose sur une analyse bioinformatique approfondie des données de séquençe du génome disponibles pour des centaines d'accessions de tomates. Il aboutira à la réalisation d'un système de capture des séquences d’ET qui permettra d’identifier rapidement et à bas coût par séquençage ciblé la position de l’ensemble ou presque des ET présents dans n’importe quel génome de tomate. L'objectif 2 implique la production de nouveaux matériels génétiques (hybrides F1). Les objectifs 2 et 3 généreront des données moléculaires en utilisant la capture de séquence d’ET, le RNA-seq (y compris dans sa composante allèle spécifique) et des mesures ciblées de l’état de méthylation de l’ADN. Des études d'association à l'échelle du génome (GWAS) seront effectuées pour identifier les changements d'expression génqiues associés aux polymorphismes d’insertions d’ET présents au voisinage. Le croisement des données générées dans ce projet avec les centaines de QTL d'importance agronomique nous permettra d'identifier les allèles ou les épiallèles candidats. Dans L’objectif 3, nous mettrons en oeuvre les méthodologies d’édition du génome et de l’épigénome afin de confirmer ces candidats. Ce projet intégratif et hautement synergique apportera un éclairage totalement nouveau sur le rôle joué par les ET dans la domestication et l’amélioration de la tomate. Les connaissances, méthodes et paradigmes générés trouveront leur première utilité dans les les programmes d'amélioration variétale. Plus généralement, nos résultats apporteront des réponses à l'une des questions fondamentales non résolues à l'ère de la génomique, à savoir le rôle des ET et de leur contrôle épigénétique dans la génération des variations phénotypiques observées au sein des espèces.

Malgré l’impact préoccupant du changement climatique sur les productions végétales, les connaissances disponibles sur les conséquences d’un taux accru de CO2 sur les maladies des plantes cultivées sont fragmentaires. Nous avons récemment établi qu’un fort taux de CO2 induit à lui seul des réponses de défense chez Arabidopsis, le haricot commun et le blé. Le projet HIPATH fédère six équipes de deux laboratoires différents pour déterminer comment un tel effet peut modifier la productivité et la résistance des espèces végétales aux agents pathogènes et afin d’en comprendre le mécanisme. HIPATH visera à identifier des gènes impliqués à l’interface entre perception du taux élevé de CO2 et réponses de défense, mettre en évidence d’éventuelles spécificités dicotylédones / monocotylédones, caractériser l’impact du fort CO2 sur les réponses de défense en conditions de plein champ, et étudier de façon ciblée la variabilité génétique naturelle pour l’exploiter dans des programmes de sélection. Dans le but d’identifier des spécificités taxonomiques de l’effet du fort CO2, les recherches seront menées chez plusieurs espèces. Le choix d’Arabidopsis favorisera des progrès rapides, grâce aux cribles génétiques, alors que l’effet du fort CO2 seront sur les réponses aux stress biotiques sera également examiné chez une plante dicot d’importance agronomique (le haricot), ainsi que deux monocots, la plant modèle Brachypodium et le blé. Le programme de travail est conçu pour générer de nouvelles informations sur la signalisation liée au CO2, dans les buts d’identifier des liens entre les voies métaboliques primaires et secondaires, de fournir de nouveaux éléments sur les voies de synthèse de l’acide salicylique chez les plantes, et d’évaluer l’impact du CO2 sur les réponses aux stress biotiques chez des différents génotypes de blé cultivés en plein champ. Des connaissances fondamentales générées dans ces domaines devront contribuer à une meilleure compréhension des conséquences d’un taux de CO2 augmenté pour la croissance des plantes, et donc aux efforts de prédire les rendements agricoles dans le contexte du changement climatique. Elles pourront également apporter des éléments utiles pour les tentatives cherchant à optimiser des conditions de “priming” qui permettent une activation plus efficace des défenses des plantes contre les envahisseurs pathogènes.

Les plantes doivent croître suffisamment rapidement pour rivaliser avec leurs voisins, et résister aux agressions permanentes d’agents pathogènes. Plutôt que d'arrêter leur croissance pour se défendre, les plantes établissent souvent un équilibre entre croissance et défense, afin de satisfaire des demandes simultanées et pourtant métaboliquement conflictuelles. Comprendre les relations entre mécanismes de croissance et ceux contrôlant les voies de défense des végétaux est une question centenaire, qui a été formulée empiriquement comme le «dilemme des plantes». Les rares études sur le sujet indiquent que les plantes utilisent un ensemble complexe de mécanismes de signalisation pour faire face à ce dilemme. Une meilleure compréhension des principales étapes et de la structure hiérarchique des réseaux de signalisation qui gère ces dilemme entre «croissance» et «défense» serait bénéfique à la fois: i) à la communauté scientifique qui cherche à comprendre les mécanismes fondamentaux intégrant la perception d'un pathogène particulier tout en subissant des changements de développement dynamiques et coordonnés; ii) à la société car des réelles perspectives appliquées utilisant les bases moléculaires des compromis entre défense et croissance peut contribuer à une meilleure productivité et qualité des productions agricoles. Afin de réguler le flux des ressources disponibles vers des programmes gouvernant la croissance ou les défenses, les plantes surveillent leur environnement à la recherche de signaux spécifiques et les transforment en réponses moléculaires complexes. Pourtant, les bases moléculaires assurant une répartition optimale d'investissements coûteux mais bénéfiques pour la défense au détriment des processus de croissance sont très peu connus. Un nombre croissant d’études montrent qu’une interaction plante-pathogène peut également être modulé via des hormones favorisant la croissance comme les brassinosteroïdes (les stéroïdes des plantes ci-après dénommées BR) ou bien le réchauffement climatique. Toutefois, l’impact des BRs et de l’augmentation de température est peu décrit pour les racines qui sont particulièrement exposées à divers agents pathogènes. L'un des objectifs principaux du projet (BUGSTER) est de définir comment la température, les BRs et les voies de signalisation de défense sont interconnectées au niveau racinaire pour aider les plantes à réguler les nombreuses décisions de compensation de la croissance et des réponses de défense qu'elles devront prendre tout au long de leur vie. La réussite de BUGSTER permettra une meilleure compréhension des mécanismes qui modulent les compromis de défenses de croissance dictées par la température et les hormones stéroïdes végétales. Les activités de recherche prévues dans le cadre de BUGSTER s'appuieront sur un projet de recherche interdisciplinaire et international réunissant deux grands groupes de recherche et institutions de France et d'Autriche, possédant une vaste expertise en matière de signalisation des BRs, d'immunité des plantes, de biologie cellulaire et de développement. BUGSTER fournira une excellente plateforme pour former de jeunes scientifiques qui seront non seulement capables de travailler et de comprendre les processus de développement des plantes face à l'immunité des plantes, mais aussi de comprendre les réponses de la défense des plantes dans le contexte de facteurs endogènes comme les hormones stéroïdes, et de facteurs environnementaux variables comme le réchauffement climatique.

L'embryon aux premiers stades de développement est très sensible aux perturbations de son environnement, qui engendrent à l'âge adulte des modifications phénotypiques différentes selon le sexe. Ceci suppose l'existence de différences sexe spécifiques très précoces. De telles différences, antérieures à l'imprégnation hormonale, et liées aux chromosomes sexuels ont été démontrées surtout chez la souris. Pourtant cette espèce est exceptionnelle parmi les mammifères par la précocité de l'inactivation du chromosome X et le grand nombre de gènes inactivés. Ceci laisse supposer des différences phénotypiques liées au sexe plus importantes chez les mammifères non murins. BoSeX-Dim a pour ambition (i) d’identifier les dimorphismes sexuels précoces chez l'embryon de bovin (ii) d'étudier comment ces dimorphismes sont modifiés en réponse à l'environnement embryonnaire et en particulier lorsque l'embryon est produit in vitro (iii) d'améliorer les conditions de production d'embryons in vitro en prenant en compte ces dimorphismes pour augmenter l'efficacité des biotechnologies de l’embryon au cœur des schémas de sélection génomique bovins. Pour atteindre ces objectifs, le consortium formé pour ce projet rassemble des compétences en biologie du développement bovin,analyse de données génomiques à haut débit dans cette espèce, analyses et intégration de données hétérogènes issues des méthodes à haut débit, et en biotechnologies de l'embryon et sélection génomique bovine. Ces compétences vont permettre d'intégrer des données collectées à trois stades de développement clefs pour la mise en place des dimorphismes sexuels: avant et après l'inactivation du chromosome X et la mise en place de la compensation de dosage génique chez les embryons/conceptus femelles, et plus tard, avant imprégnation hormonale, lorsque les gonades fœtales sont considérées comme encore indifférenciées. La nouveauté du projet repose sur l'intégration de données hétérogènes (morphocinétique, métabolome, transcriptome, méthylome et génome) obtenues à trois stades différents, pour répondre à une question encore peu documentée chez le bovin bien que cruciale pour la recherche fondamentale et appliquée. Tirant parti des connaissances scientifiques acquises dans la première partie du projet, nous améliorerons les milieux de culture in vitro afin de rendre les embryons mâles ou femelles produits in vitro plus proches de ceux développés in vivo. Ceci devrait améliorer leur qualité et leur aptitude à la congélation, augmentant ainsi l'efficacité des biotechnologies de l'embryon afin d'en accroître l'usage dans les schémas de sélection où les embryons bovins mâle et femelle ont un devenir distinct. Les embryons mâles sont congelés dans l'attente des résultats de leur génotypage, puis seuls les meilleurs d'entre eux sont transférés dans des femelles receveuses pour produire la prochaine génération de taureaux d'élite pour l'insémination artificielle. Les embryons femelles sont le plus souvent transférés sans congélation préalable pour assurer le renouvellement des femelles. Sur le plan fondamental, comprendre comment les dimorphismes sexuels se mettent en place permettra de mieux comprendre les réponses sex-dimorphiques à des perturbations de l'environnement; cela permettra à de prendre en compte ces différences sex-spécifiques lors de la conduite des gestations dans les élevages bovins.

Les Streptomycètes sont des bactéries du sol retrouvées dans une large diversité d'habitats naturels et en particulier au niveau de la rhizosphère, une zone à proximité immédiate des racines des plantes. Ces microorganismes sont caractérisés par leur capacité à produire une immense diversité de métabolites spécialisés présentant notamment des activés anti-bactériennes et anti-fongiques. Ainsi, plus des 2/3 des antibiotiques utilisés en médecine ont pour origine des Streptomycètes. Des études récentes ont montré que les Streptomycètes jouaient également un rôle important dans la santé des plantes en entrant en compétition avec des microorganismes phytopathogènes. Dans ce contexte, l'identification et la caractérisation de souches de Streptomycètes bénéfiques pour les plantes pourraient avoir un impact majeur dans le développement de nouvelles solutions phytosanitaires respectueuses de l'environnement. Malgré leurs capacité à produire des molécules actives en laboratoire, seulement quelques souches ont été utilisées jusqu'à présent pour le développement de produits phytosanitaires, suggérant qu'une meilleure connaissance de ces organismes et de leur comportement dans les milieux naturels sont nécessaires afin d’optimiser leur utilisation. Le projet STREPTOCONTROL a pour but de comprendre l'activité biologique et d'optimiser l'utilisation d'une souche de Streptomyces, sélectionnée à la suite d'une stratégie de criblage visant à isoler des bactéries capables d'induire le système immunitaire des plantes et de produire des activité inhibitrices de la croissance de champignons phytopathogènes. La pulvérisation de spores ou de mycélium d'AGN23 à la surface de feuilles protège les plantes d'infections microbiennes suggérant son utilisation possible dans des formulations phytosanitaires. Cependant, le mode d'action de cette souche n'est pas connu, ainsi que son comportement dans le milieu naturel. Le premier objectif du projet STREPTOCONTROL d’identifier les métabolites spécialisés actifs de la souche sélectionnée en utilisant une combinaison d'approches génomiques, génétiques et biochimiques. Pour atteindre cet objectif, une séquence génomique haute qualité d’AGN23 sera obtenue et annotée, permettant de prédire les clusters de gènes impliqués dans la synthèse de métabolites spécialisés et les éléments régulateurs de ces gènes, aidant ainsi l'identification biochimique de ces métabolites. Des outils de criblage haut-débit seront utilisés pour identifier et caractériser les fractions actives et les structures des composés seront obtenues par analyse en spectrométrie de masse et RMN. Le deuxième objectif visera à identifier les gènes clefs dans la production des métabolites d'intérêt par des études moléculaires et génétiques. Une collection récemment obtenue de mutants d’AGN23 sera criblée afin d’identifier les mutants sous et surproducteurs de composés actifs. Le reséquençage des mutants ainsi obtenus permettra d’identifier les mutations causales et les gènes impliqués. Des approches complémentaires utiliseront la technologie CRISPR/CAS9 récemment mise au point pour les Streptomycètes afin d’inactiver chaque cluster de métabolites spécialisés et d’évaluer le phénotype des souches modifiées. Le troisième objectif vise à comprendre le comportement de la souche dans des conditions environnementales contrôlées en présence de divers types d'espèces végétales et microbiennes. L'obtention de souches rapportrices permettra de suivre l’expression de gènes impliqués dans la synthèse de composés actifs et d’identifier les facteurs environnementaux important pour leur régulation. L'ensemble du projet STREPTOCONTROL apportera de nouvelles connaissances fondamentales sur l'activité des Streptomyces au sein de la rhizosphère et aidera à leur développement pour mettre au point de nouveaux produits de protection des plantes plus respectueux de l'environnement.

Le but du projet Path2Bos est de reconstituer l’évolution génomique des bovins depuis leur domestication initiale, il y a 10,000 ans en Anatolie, jusqu’à nos jours, en utilisant une analyse paléogénomique de témoins directs de cette évolution. Il s’agit d’identifier les régions génomiques codant pour les caractères qui ont été sélectionnés initialement et qu’il serait donc important de préserver lors des sélections génétiques actuelles. Le projet repose sur une caractérisation paléogénétique préalable de ~700 échantillons d’ossements archéologiques vieux de ~9000 à 1000 ans et correspondant à des bœufs domestiques anciens ainsi qu’à leur ancêtre sauvage, l’aurochs. Nous avons génotypé le génome mitochondrial et séquencé sa région hypervariable à partir d’environ 200 échantillons anciens permettant de suivre l’évolution des haplotypes des différentes populations anciennes depuis la domestication initiale en Anatolie et leur évolution en Europe et en Afrique du Nord depuis le Néolithique jusqu’au Moyen-Age. Grâce à la capture de séquence, nous avons obtenu le mitogénome complet de 40 échantillons représentatifs qui nous ont permis de dater les événements de radiation des différentes populations d’aurochs ancestrales et ainsi de distinguer la contribution des changements climatiques à la transition Pléistocène-Holocène des événements dus à leur domestication. Nous avons séquencé le génome d’un aurochs anatolien de 9,000 ans, ancestral aux populations domestiquées, qui nous servira de référence pour suivre les changements génomiques et les pressions de sélection qui se sont exercées lors de la domestication. Nous proposons de séquencer une trentaine de génomes anciens afin de les comparer avec une abondante base de données génomiques et phénotypiques de bœufs modernes pour reconstruire les pressions sélectives réalisées aux différentes phases préhistoriques et historiques. Nous séquencerons aussi les génomes de plusieurs races rustiques afin de caractériser les variations génétiques ancestrales qui sont maintenant perdues, ou en cours de l’être, au sein des populations bovines actuelles intensivement sélectionnées. Nous utiliserons des approches statistiques élaborées par un des partenaires pour identifier les régions sous sélection et pour caractériser les paramètres associés, force, âge et étendue de la sélection, degré d’accomplissement... En combinant les résultats de GWAS obtenus par un des partenaires et les génotypes observés chez les génomes ancestraux, nous serons à même de reconstruire l 'évolution de plusieurs caractères polygéniques au cours de l'histoire des bovins domestiques. Notre projet permettra (1) d’améliorer la détection des régions sous sélection dans le génome bovin, (2) d'estimer l'intensité de la sélection dans chaque région, ainsi que la période, la zone géographique et le caractère concernés, (3) de caractériser la variabilité ancienne impliquée dans des traits importants pour l'espèce domestique mais risquant d'être perdue en raison de la sélection intensive récente, et de contribuer ainsi à la durabilité des pratiques de sélection des bovins. Par conséquent, Path2Bos permettra degénérer une nouvelle forme d’annotation du génome bovin qui enrichira les stratégies actuelles de sélection. Un des points forts du projet est l’originalité des observations génomiques obtenues. Un autre point fort est la complémentarité des expertises des différents membres du consortium, de la paléogénomique à la statistique et la génétique des populations, et des jeux de données qu’ils ont accumulés (grande collection d'échantillons archéologiques d'une part, et d'individus génotypés et phénotypés d'autre part).

La maîtrise du risque microbiologique au niveau réglementaire est essentiellement basée sur la notion de seuil de contamination. Ce seuil ne prend pas en compte l’hétérogénéité de la population des pathogènes au sein de cet environnement complexe qu’est l’aliment. En effet, dans une matrice alimentaire, différents microenvironnements coexistent et se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques et biochimiques et leurs communautés microbiennes endogènes. L'hétérogénéité phénotypique, observable au niveau de la cellule unique est une caractéristique intrinsèque des bactéries qui doit être prise en considération pour contrôler les pathogènes d'origine alimentaire. Ainsi, l'évaluation quantitative des risques microbiologiques doit englober la variabilité microbienne. L’objectif du projet est de comprendre l'hétérogénéité cellulaire et la répartition spatiale de bactéries pathogènes en interaction avec les communautés microbiennes des aliments en caractérisant leur physiologie à l’échelle de leur microenvironnement. Il vise ensuite à modéliser le comportement de ces bactéries pathogènes en prenant en compte l’écosystème alimentaire. Le projet PathoFood est ciblé sur la caractérisation de deux bactéries pathogènes d'origine alimentaire qui généralement contaminent les aliments à des niveaux initiaux très bas : Listeria monocytogenes et Escherichia coli O157:H7. Ces deux pathogènes ne représentent que quelques cas d'infection par an dues à l’ingestion d’aliments contaminés, mais sont responsables de séquelles graves pour les patients. Les produits alimentaires ciblés sont la viande avec le steak haché de bœuf et les fromages avec un fromage de type pâte molle en raison du risque microbiologique qu’ils peuvent représenter vis-à-vis d’une contamination à L. monocytogenes et E. coli O157:H7 et de l’importante hétérogénéité de ces matrices alimentaires. Dans ces matrices complexes, ces pathogènes rencontreront de multiples microenvironnements et pourront interagir avec les communautés microbiennes en présence. La capacité d’adaptation, la croissance et la survie de L. monocytogenes et E. coli O157:H7, ainsi que leur hétérogénéité cellulaire et leur distribution spatiale en interaction avec le microenvironnement alimentaire seront caractérisées. De plus, les déterminants moléculaires impliqués dans leur interaction avec les composants de la matrice alimentaire seront identifiés. Les impacts des communautés microbiennes, prédominantes dans un steak haché et chez un fromage à pâte molle, sur la physiologie et la localisation spatiale de ces deux pathogènes seront évalués. Les données générées sur l’effet de ces différentes interactions seront utilisées pour élaborer des modèles mathématiques prédictifs. Ces modèles seront validés dans les écosystèmes du steak haché et du fromage à pâte molle. Une meilleure compréhension des interactions des bactéries pathogènes avec les écosystèmes alimentaires, en prenant en compte le biotope et la biocénose, reste un défi crucial pour prédire l’évolution de ces pathogènes dans les aliments et ainsi améliorer leur sécurité microbiologique.