Dynamique moléculaire de la transformation hématopoïétique

L'hématopoïèse clonale de potentiel indéterminé (CHIP) est associée à un risque accru de développer des maladies inflammatoires liées à l'âge. Ce phénomène serait lié à une différenciation biaisée des cellules souches hématopoïétiques (CSH) en cellules myéloïdes inflammatoires, mais les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués restent mal compris. La CHIP est principalement due à des mutations dans des facteurs épigénétiques tels que TET2. La perte de la marque d’hétérochromatine H3K9me3, qui joue un rôle majeur dans la répression des éléments transposables (TE), induit un biais myéloïde. Les TE jouent un rôle crucial dans les réseaux de régulation génique. Nous émettons l'hypothèse que la perte d'hétérochromatine aux TE et l'altération de l'activité de facteurs de transcription (FT) pourraient participer au biais myéloïde dans la CHIP. Nous utiliserons le traçage de lignées pour identifier les origines cellulaires du biais myéloïde lors de la perte de TET2 et pendant l'inflammation chronique mimant le vieillissement. Le rôle enhancer des TE sera évalué par des approches multi-omiques étudiant l'ouverture de la chromatine, la méthylation de l'ADN et différentes marques d'histones aux TE dans les CSH et leurs progéniteurs dans ces conditions. En parallèle, nous utiliserons des modèles mathématiques pour générer des réseaux booléens de l'activité des facteurs de transcription (FT) dans ces cellules. Enfin, nous modulerons l’expression des FT pour valider la collaboration TE/FT dans les modifications du transcriptome et de la fonction des CSH et des progéniteurs myéloïdes. TECHROCHIP réunit trois partenaires ayant l'expertise nécessaire et complémentaire dans des approches de pointe et des modèles génétiques uniques afin de définir la fonction des TE en tant qu'activateurs de réseaux transcriptionnels induisant un biais myéloïde dans la CHIP. Ce projet pourrait révéler de nouvelles stratégies pour limiter ou prévenir les maladies inflammatoires liées à l'âge

La présence de défauts qualitatifs/quantitatifs d’érythropoïèse est une caractéristique de nombreux troubles hématologiques dont les ß-thalassémies, l'anémie dysérythropoïétique congénitale (ADC) et l'anémie de Blackfan-Diamond (ABD). L’ABD est un syndrome rare d'insuffisance médullaire congénitale présentant un phénotype érythroïde spécifique. Dans au moins 70 % des cas, l’ABD est associé à une mutation germinale haplo-insuffisante d'un gène de protéine ribosomique (RP), entraînant une altération de la biogenèse des ribosomes. Le fait que des mutations dans 20 protéines ribosomiques (PRs) entraînent une anémie et une insuffisance médullaire, avec un impact beaucoup plus minime sur d'autres tissus, met en évidence la nature critique de la traduction protéique au cours de l'érythropoïèse. Cependant, à ce jour, le lien entre l'augmentation de la traduction protéique au cours de la différenciation érythroïde et l'environnement métabolique des progéniteurs hématopoïétiques n'a pas été identifié. Nous avons notamment déterminé que la captation d'arginine médiée par SLC7A1/CAT1 et son catabolisme en polyamine spermidine contrôlent la différenciation érythroïde en régulant la traduction des protéines par l'intermédiaire du facteur de traduction eucaryote 5A (eIF5A). eIF5A régule l'élongation et la terminaison de la traduction et son activité est dépendante d’une modification post-traductionnelle, appelée hypusination. Cette modification post-traductionnelle, qui résulte de la conjugaison de la partie amino-butyle de la spermidine à la lysine, est nécessaire à l'activité d'eIF5A. Alors qu'il a été récemment démontré que l'hypusination de l'eIF5A régule la croissance des cellules cancéreuses, ainsi que des cellules immunes, nos données sont les premières à identifier un rôle pour l'hypusination d'eIF5A au cours de la différenciation érythroïde. En outre, nos analyses protéomiques quantitatives ont identifié la traduction mitochondriale comme une cible d’eIF5A. Nos données mettent donc en évidence une voie de régulation dans laquelle le métabolisme de l'arginine contrôle l'hypusination d’eIF5A et la fonction mitochondriale, dirigeant ainsi la différenciation érythroïde. Nous émettons l'hypothèse que l'axe arginine-polyamine-hypusine régule un « crosstalk » entre eIF5A et les petites et grandes protéines ribosomales, modulant à la fois l'érythropoïèse physiologique et la différenciation érythroïde pathologique qui caractérise l’ABD. Les objectifs du projet proposé ici sont d'élucider l'impact de l'utilisation des carbones de l’arginine en fonction de la différenciation érythroïde, d’obtenir des données génomiques fonctionnelles qui renseignent sur les mécanismes par lesquels l'axe arginine-polyamine-hypusine contrôle la différenciation érythroïde des progéniteurs sains et ABD, et d'évaluer le potentiel d’agents qui augmentent la phosphorylation mitochondriale et la synthèse protéique pour stimuler la différenciation érythroïde par le biais des réseaux RP-eIF5A. Ce projet pourrait donc conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients atteints d’ABD.

L'anémie de Fanconi (AF) est un syndrome rare d'insuffisance médullaire (BMF) présentant des anomalies des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, une anémie, une thrombocytopénie et un risque accru d'évolution vers une myélodysplasie et une leucémie myéloïde aiguë. Bien que la BMF dans l'AF est pensée être due à l'altération de la réponse aux dommages de l'ADN et de l'instabilité génétique associée, nous avons actuellement une compréhension encore largement imparfaite du lien entre l'inactivation génétique d'une protéine FANC, les altérations de la réparation de l'ADN associées et leurs conséquences en termes de résultats cellulaires et cliniques. Nous avons récemment décrit que les cellules mutées FANCA présentent des anomalies nucléolaires/ribosomiques ayant un impact sur le taux de traduction. Nous proposons que la BMF, l'érythropénie et la thrombocytopénie dans l'AF reposent sur des défauts du transcriptome et du translatome plutôt que sur une stabilité génétique altérée. Notre hypothèse est que les altérations du nucléole, de la biogénèse des ribosomes et de la traduction caractérisées chez les patients déficients en FANCA (70% des patients atteints d'AF), affectent l'homéostasie de la moëlle osseuse, la méga- et érythropoïèse, deux processus affectés par de tels mécanismes moléculaires. Pour étudier notre hypothèse, le projet sera séparé en 6 volets visant à : 1- caractériser l'activité nucléolaire, ribosomale et les mécanismes de traduction dans les cellules hématopoïétiques de souris Fanca+/+ et Fanca-/- in vivo. 2- Caractériser l'activité nucléolaire, l'activité des ribosomes et les mécanismes de traduction pendant l'érythropoïèse dans des cellules primaires ou des lignées cellulaires in vitro de souris Fanca+/+ et Fanca-/-. 3- caractériser l'activité des nucléoles et des ribosomes pendant l'érythropoïèse dans un modèle cellulaire primaire humain FANCA-proficient et déficient. 4- caractériser l'activité nucléolaire et ribosomale dans les mégacaryocytes provenant de cellules primaires murines Fanca+/+ et Fanca-/- ou de cellules CD34+ humaines. 5- caractériser l'activité translationnelle dans les réticulocytes énucléés différenciés en phase terminale et les plaquettes provenant de cellules de souris Fanca+/+ et Fanca-/-. 6- tester des stratégies pour restaurer les déficiences de traduction dans les FA. Ces connaissances, nécessaires pour développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d'améliorer les soins aux patients atteints d'AF, permettront, incidemment, de mieux comprendre l'hématopoïèse normale. Grâce à la disponibilité de molécules capables de moduler les médiateurs associés aux anomalies nucléolaires et ribosomiques, nos observations ouvriront de nouvelles perspectives thérapeutiques pour tester et améliorer la santé des patients atteints d'AF.

Les thrombopénies chroniques isolées (TCI) sont des maladies fréquentes; la plupart d’entre elles sont liées à une destruction auto-immune des plaquettes et de leurs précurseurs médullaires, les mégacaryocytes (MK) et sont appelées Purpura Thrombopéniques Immunologiques (PTI). Cependant le PTI est un diagnostic d’exclusion faute de critères diagnostiques indiscutables, si bien que certaines TCI sont étiquetées PTI alors qu’elles ne sont pas d’origine immunologique. Nous avons montré que certaines d’entre elles étaient en fait des maladies hématologiques, dues à un défaut isolé de formation de proplaquettes par le MK, l’étape qui précède la libération des plaquettes. Pour cette raison, nous avons appelé ces TCI, Thrombopénies acquises chroniques de signification indéterminée (ICTUS en anglais). Comme nous avions montré antérieurement chez la souris que la protéine Bcl-xl, membre anti-apoptotique de la famille Bcl2, était indispensable à la formation des proplaquettes et la survie des plaquettes, nous avons émis l’hypothèse que les ICTUS pourraient être liés à une diminution de l’expression de Bcl-xL. Nous avons confirmé cette hypothèse en montrant une expression diminuée de Bcl-xL plaquettaire chez quelques patients aussi bien au niveau du transcrit que de la protéine. En plus nous avons montré que cette pathologie était associée à une inactivation non aléatoire du chromosome X, suggérant très fortement une hématopoïèse clonale. Ceci nous laisse penser que les ICTUS sont une forme d’hématopoïèse clonale de signification indéterminée (CHIP) associée à une thrombopénie qui serait la conséquence d’une diminution de Bcl-xL. Le but de ce projet est de mieux identifier cette nouvelle entité et d’en faciliter le diagnostic en développant un nouveau biomarqueur tel que l’expression plaquettaire de Bcl-xL. Cette approche permettra d’améliorer le diagnostic de TCI et les indications thérapeutiques. Le projet est divisé en 4 grandes taches médico-scientifiques. La première est consacrée à démontrer que cette hématopoïèse clonale est la conséquence de mutations acquises dans le système hématopoïétique. Pour cela nos utiliserons un abord pangénomique basé sur le séquençage de nouvelle génération (SNG), des CGH arrays et de l’ARN-Seq. Nous pensons identifier des mutations récurrentes qui permettront de définir le profil génomique des ICTUS. La seconde est dédiée à l’étude du rôle précis de Bcl-xL dans la mégacaryopoïèse humaine sachant que son rôle a été jusqu’alors uniquement caractérisé chez la souris. La troisième tâche a pour objectif d’identifier le mécanisme responsable du défaut d’expression de Bcl-xL chez les patients ICTUS, en essayant de faire un lien direct avec le profil mutationnel et les voies de signalisation dérégulées. Dans la dernière tâche, nous évaluerons si la mesure de la quantité de Bcl-xL s’avère être un bon biomarqueur des ICTUS et nous développerons de nouveaux anticorps dirigés spécifiquement contre Bcl-xL afin de les utiliser en cytométrie de flux et de détecter le niveau de Bcl-xL plaquettaire. En outre l’approche génomique devrait nous permettre de réaliser un SNG ciblé qui facilitera le diagnostic des TCI. Ce projet est rendu réalisable par le fait que 3 partenaires (deux scientifiques et une équipe clinique) vont collaborer étroitement pour la sélection des patients et la réalisation des expériences. Les 2 partenaires scientifiques ont une expertise reconnue dans la biologie cellulaire et moléculaire de la mégacaryopoïèse normale et pathologique. Le coordinateur Mme Chloé James a réalisé tout le travail préliminaire et a identifié cette nouvelle entité. Les partenaires cliniques ont une réputation reconnue internationalement sur le diagnostic des TCI et plus particulièrement des PTI et font partie du centre de référence des PTI. A la fin du projet, nous espérons avoir grandement amélioré le diagnostic des TCI en ayant défini de nouveaux critères diagnostiques et la physiopathologie des ICTUS.

La morphogenèse et la motilité cellulaire sont des processus cruciaux à toutes les étapes de la vie, depuis le développement jusqu’à l’homéostasie des tissus, et sont associées des états pathologiques tels que les cancers. Les cellules migrantes doivent rapidement adapter leur programme morphogénétique aux conditions continuellement changeantes de l’environnement, ce qui implique une intégration spatiotemporelle finement régulée d’une variété de signaux biochimiques et physiques. Comprendre comment les cellules en migration lisent et interprètent ces stimuli mécano-chimiques est un des grands challenges de la biologie cellulaire moderne. La machinerie d’acto-myosine est le moteur principal de la locomotion qui en poussant et/ou en tirant sur la membrane plasmique contrôle l’extension de protrusions, la formation de nouvelles adhérences à l’avant des cellules, et leur détachement à l’arrière. Ces processus dépendent et influencent la tension de la membrane cellulaire. De plus, les obstacles rencontrés sur le chemin des cellules en migration ainsi que la géométrie de l’environnement traversé peuvent également perturber localement la tension membranaire. Ainsi, la tension membranaire est un intégrateur clé des signaux mécaniques et a été impliquée dans la migration cellulaire. Les partenaires P1 &P3 ont récemment démontré que les cavéoles, ces petites invaginations de la membrane plasmique, tamponnent la tension de membrane en s’aplatissant dans celle-ci lorsqu’elle se tend suite à un stress mécanique. Les données préliminaires de P1 suggèrent de plus que l’aplatissement des cavéoles est également associé à la régulation sélective de cascades de signalisation et au contrôle de la transcription de certains gènes. Les résultats préliminaires de P2 suggèrent par ailleurs que les cavéoles peuvent directement détecter les modulations de tension de membrane au travers un réseau 3D organisé de fibres de collagène. Alors que la tension de membrane et les cavéoles ont toutes deux été impliquées dans certains aspects de la migration cellulaire, on ne sait pas si la modulation de la tension de membrane par les cavéoles joue un rôle dans la motilité cellulaire. Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle des cavéoles et de la tension de membrane au cours de la migration. Nous déterminerons comment, en impactant la tension de membrane, les cavéoles régulent la migration. Nous étudierons comment les cavéoles, en contrôlant des voies de signalisation sélectives et la mécanotransduction, peuvent avoir un impact sur la motilité cellulaire. Enfin, nous déterminerons comment les signaux chimiques et mécaniques ressentis par les cavéoles sont intégrés avec l’organisation et la dynamique du cytosquelette d’actine pour orienter la migration cellulaire.

Classiquement, les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont considérées comme de simples fournisseurs d'un nombre suffisant, et équilibré, de cellules matures alors que la régulation de la réaction immunitaire, ainsi que la mémoire à long terme des infections précédentes, ont été jusqu’à maintenant exclusivement attribuées aux cellules différenciées du système immunitaire. Ainsi, seules, les cellules mémoire du système immunitaire adaptatif, lymphocytes B ou T, sont reconnues pour avoir une mémoire immunitaire, qui implique des modifications génétiques, maintenue à long terme dans des cellules dédiées. Plus récemment, un phénomène nommé « immunité entrainée » a été décrit pour les cellules immunitaires innées telles que les cellules NK et les macrophages qui peuvent également maintenir à long terme une mémoire épigénétique. Dans le projet proposé ici, nous voulons étudier si une telle mémoire épigénétique d’un challenge immunitaire antérieur existe au niveau des CSH et si cette mémoire pourrait déterminer les quantités, la composition et l'activation des leucocytes matures produits en réponse à un stimulus secondaire. Nous voulons déterminer quelles sont les voies de signalisation et les changements épigénétiques impliqués au niveau des CSH, en réponse à une infection. Nous analyserons des conséquences directes sur l'engagement myéloïde, la composition en cellules myéloïdes matures produites et les changements épigénétiques à long terme qui pourraient préparer les CSH à répondre plus efficacement à une deuxième stimulation. Nous utiliserons une approche combinée utilisant la des modèles de souris génétiquement modifiées et humanisées, et des approches génomiques sur des cellules murines et humaines pour aborder ces questions, tirant profit de l'expertise complémentaire des laboratoires partenaires. La démonstration de l’existence d’une mémoire épigénétique au niveau des CSH serait une révolution, d’une part en raison de la durée de vie longue de ces cellules et donc de la longévité que cela implique pour leur mémoire et d’autre part parce que les CSH sont au sommet de la hiérarchie de différenciation du système immunitaire et pourraient donc largement influencer les futures réactions immunitaires. Ainsi, les CSH pourraient devenir dans le futur les cibles centrales des recherches en immunologie et des stratégies de vaccination. Cette découverte pourrait aussi avoir un impact majeur sur des questions de santé publique liées à l'hypothèse hygiéniste. Enfin, ceci pourrait également avoir des conséquences importantes pour la gestion des protocoles actuels de transplantation des CSH et même ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour ces transplantations.