Neuro-Bicêtre

Des modifications synaptiques en fonction du développement et de l'activité sont considérées être à la base de l'apprentissage et de la mémoire. Or, les synapses sont des structures microscopiques qui ne contiennent souvent que des dizaines ou des centaines de récepteurs de neurotransmetteurs responsables de la transmission synaptique, et qui sont donc exposées à des fluctuations moléculaires. Comment les synapses peuvent-elles résister à des modifications accidentelles tout en restant sensibles à l'activité neuronale qui entraîne des changements plastiques ? Pour y répondre, il est nécessaire de comprendre les mécanismes biophysiques qui régissent l'accumulation des récepteurs de neurotransmetteurs dans les domaines synaptiques et contrôlent leur taille. Nous nous concentrons ici sur les domaines postsynaptiques inhibiteurs (iPSD), dont la composition moléculaire et la morphologie sont moins complexes que celles des synapses excitatrices, mais qui partagent de nombreux principes d'organisation. Les iPSD glycinergiques de la moelle épinière et du tronc cérébral sont constitués de récepteurs de la glycine (GlyR) qui sont concentrés à la synapse par des interactions avec la géphyrine, la principale protéine d'échafaudage des synapses inhibitrices. Dans le cortex, la transmission inhibitrice repose principalement sur les synapses GABAergiques, qui jouent un rôle important dans le stockage de l'information. Plusieurs neuropathologies ont été liées à un dysfonctionnement de la transmission synaptique GABA- et glycinergique. Des questions restent ouvertes sur les mécanismes biophysiques qui régissent quantitativement la dynamique de la taille des synapses inhibitrices : (1) Comment la taille des synapses et leur stabilité face aux perturbations sont-elles maintenues et quels sont les paramètres biophysiques pertinents ? (2) Quels mécanismes régulent l'organisation spatiale des récepteurs synaptiques et extrasynaptiques, et quelles sont les implications pour le « cross-talk » entre synapses voisines ? (3) Quelles sont les « leviers » biophysiques qui permettent des modifications plastiques des synapses, et comment sont-ils liés aux voies connues de la plasticité inhibitrice ? Nous aborderons ces questions en combinant la modélisation biophysique détaillée des iPSD et l'imagerie quantitative et dynamique des GlyRs, des GABAARs et de la géphyrine des synapses inhibitrices dans des cultures de moelle épinière et d'hippocampe. Le projet sera structuré en trois parties : (i) Conception du modèle, basé sur des particules, de la dynamique combinée des récepteurs et des protéines d'échafaudage à la membrane postsynaptique et extrasynaptique, (ii) Des expériences d'imagerie pour quantifier la diffusion, l’agrégation et la cinétique d'échange des récepteurs et de la géphyrine en utilisant la microscopie conventionnelle (FRAP) et la microscopie de localisation à molécule unique (SMLM), et (iii) L'application des prédictions du modèle de la composition et de la dynamique perturbées de l'iPSD dans des conditions pharmacologiques et pathologiques. Pour ce faire, nous testerons les effets des stéroïdes neuroactifs utilisés cliniquement pour le traitement des troubles de l'humeur, ainsi que les auto-anticorps du récepteur GABAA qui déclenchent des phénotypes neuropsychiatriques chez les patients. Notre approche interdisciplinaire nous permettra de concevoir des expériences ciblées basées sur les prédictions du modèle et de fonder notre modélisation sur des données expérimentales. Un modèle quantitatif des iPSD qui tient compte de la dynamique spatio-temporelle couplée des différents sous-types de récepteurs et de la géphyrine nous permettra de développer une compréhension mécaniste des fluctuations du nombre de protéines synaptiques, de leur organisation spatiale subsynaptique, ainsi que des effets des formes physiologiques et pathologique de la plasticité synaptique.

Contexte scientifique. L'oligomérisation de protéines membranaires est nécessaire pour la signalisation et le trafic dans les tissus sains ou malades. De nombreux travaux théoriques ont ?été?consacrés à déterminer les mécanismes physiques qui conduisent à ce processus, en particulier les interactions médiées par les membranes, mais très peu d'expériences ont permis de les tester quantitativement. Pour relever ce défi, nous avons conçu un nanosenseur de force basé sur la nanotechnologie ADN pour mesurer, pour la première fois, les forces développées lors de la formation de dimères et d'oligomères de protéines membranaires. Nous appliquerons ce nanosenseur à 2 systèmes complémentaires : i) la sous-unit? B de la toxine de Shiga (STxB), partie d'un agent pathogène humain qui se lie à son récepteur glycolipidique Gb3 à la membrane plasmique, et est utilisé comme outil pour l'administration d’immunomodulateurs pour l’immunothérapie anticancéreuse ; ii) Patched homolog 1 (Ptch1), une protéine transmembranaire de la voie de signalisation morphogène Hedgehog (Hh), dont l'activité de pompe à efflux du cholestérol et de médicaments contribue à la résistance à la chimiothérapie anticancéreuse. Principaux objectifs et méthodes du projet. Notre projet interdisciplinaire réunit des physiciens expérimentaux et théoriciens, des biochimistes et des chémobiologistes cellulaires pour : - Calibrer mécaniquement notre nanosenseur pour la mesure directe de forces entre protéines membranaires de l'ordre du pN (ligation ADN-protéine, transfert d'énergie de fluorescence par résonance en molécule unique (smFRET), microscopie interférentielle par diffusion (iSCAT), théorie). - Utiliser le nanosenseur étalonné pour mesurer les forces entre 2 molécules de STxB liées à la membrane, et leur variation avec la tension membranaire, la structure moléculaire du Gb3 et la machinerie cytosolique (aspiration par micropipette, synthèse chimique de glycolipides et reconstitution dans des membranes modèles ou des cellules). - L'utiliser pour mesurer, sur des membranes modèles ou cellulaires, comment les interactions entre 2 protéines Ptch1 sont modulées par leur ligand Hh, la composition lipidique de la membrane, la machinerie cytosolique ou par des petites molécules inhibitrices utilisées pour renforcer la chimiothérapie anticancéreuse (construction fonctionnelle de Ptch1 modifiée par un acide aminé non naturel, purification et reconstitution dans des vésicules unilamellaires géantes, ligation ADN-protéine sur membrane). Résultats attendus. Avec ce projet nous espérons développer un outil novateur en biophysique des membranes qui permettra de tester quantitativement les modèles théoriques sur l'oligomérisation des protéines et d'obtenir des conclusions solides sur les mécanismes sous-jacents. Notre nanosenseur sera le premier qui permette de mesurer directement des forces attractives entre protéines membranaires. Grâce à cet outil unique, nous espérons notamment démontrer que les forces induites par les fluctuations (de type "Casimir"), peu étudiées jusque-là, jouent un rôle clé dans l'oligomérisation. En outre, notre projet devrait permettre de trancher si les oligomères de Ptch1 préexistent ou non à la liaison de Hh et s'ils sont nécessaires à ses activités de transport du cholestérol et d'efflux de médicaments, indépendantes de Hh. D'autres protéines membranaires, telles que les récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs HER2 ou les récepteurs de cytokines, doivent aussi s'oligomériser pour permettre leurs fonctions de signalisation ; notre nanosenseur devrait donc ouvrir de nouvelles perspectives dans la recherche sur ces récepteurs, importants sur les plans physiologique et pathologique. De plus, la résistance aux médicaments conférée par l'expression de Ptch1 dans les tumeurs est un domaine d'intérêt croissant ; il existe donc un marché potentiel pour des outils comme notre nanosenseur de force pour résoudre ce challenge dans le traiteme

Les troubles neurodéveloppementaux (TN) tels que les troubles du spectre autistique (TSA) constituent un fardeau majeur pour nos sociétés. De manière surprenante, leurs bases neurobiologiques restent incomplètement définies au-delà des contributions neuronales et synaptiques. Des travaux utilisant des techniques à haut débit ont jeté un nouvel éclairage sur la complexité du cerveau et ont mis en évidence une plus grande diversité cellulaire que prévue dans le cortex cérébral mature. Cependant, l'étendue de cette diversité cellulaire n'est pas encore totalement appréhendée et la contribution individuelle de sous-types corticaux distincts à l'étiologie des TN reste inexplorée. De plus, comment cette diversité apparaît au cours du développement cortical et comment elle se traduit par des différences fonctionnelles sont des questions auxquelles il est primordial de répondre in vivo. Nous avons récemment découvert une nouvelle source de cellules corticales en dehors du pool de progéniteurs corticaux. Nous avons comme objectif à présent de caractériser les propriétés cellulaires et moléculaires de ces progéniteurs sous-palliaux, leur migration et les caractéristiques moléculaires et fonctionnelles spécifiquement acquises par leur descendance corticale. À cette fin, notre consortium de quatre experts complémentaires utilisera un large répertoire technique reposant sur des méthodes multicolores de suivi du lignage cellulaire et d’imagerie, associées à des études moléculaires et physiologiques pour explorer in vivo la génération et les fonctions des sous-types corticaux récemment identifiés dérivés du sous-pallium dans un contexte physiologique ou de TSA. Ces travaux permettront de mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires précoces responsables de la genèse et du maintien de la diversité cellulaire corticale au cours du développement cérébral et révéler ainsi de nouvelles pistes diagnostiques et thérapeutiques pour lutter contre les TSA.

Le projet SerozeroSEP vise à étudier l'intérêt du récepteur 5-HT7 de la sérotonine comme nouvelle cible thérapeutique pour le traitement de la sclérose en plaques (SEP), une maladie liée à un dysfonctionnement du système immunitaire qui entraine des lésions cérébrales (démyélinisation, dommages axonaux, neuroinflammation). Si des traitements existent pour ralentir la progression de la maladie, il n'existe pas de traitement curatif. Le récepteur 5-HT7, déjà impliqué dans d'autres maladies inflammatoires chroniques, est présent sur les cellules immunitaires et cérébrales. Nous avons identifié un agoniste biaisé du 5-HT7 au profil pharmacologique inédit qui est capable de réduire les signes cliniques et pathologiques dans un modèle animal de la SEP. Dans ce projet nous souhaitons comprendre son intérêt thérapeutique au niveau central et périphérique par une approche multidisciplinaire qui s'appuie sur des compétences complémentaires des différents partenaires. Le consortium réunit des chimistes, neuropharmacologues, neurobiologistes ayant une forte expertise dans l’étude de la SEP et des neuroscientifiques spécialisés dans la neuro-imagerie.

Une étude innovante a montré que l’administration par voie intraveineuse de nanomédicaments à base de Leu-enképhaline (LENK) couplée au squalène, un lipide endogène, présentait un effet antinociceptif prolongé dans un modèle de douleur inflammatoire chez le rat. NANOPAINKILL vise maintenant à répondre aux questions suivantes: Peut-on utiliser la même approche avec des inhibiteurs d’enképhalinases tels que l’opiorphine (OPN)? Peut-on améliorer l’activité antinociceptive avec des nanoparticules de LENK combinées aux OPN? L’administration de ces nanomédicaments par des voies autres que l'intraveineuse permet-elle d'obtenir un effet anti-nociceptif intéressant? Ces nanomédicaments sont-ils efficaces sur d’autres types de douleurs, telles que neuropathiques, post opératoires ou cancéreuses? L’utilisation des nanomédicaments à base de LENK et/ou OPN permet-elle réellement d’éviter des effets secondaires et une sensibilisation centrale comme c’est le cas avec la morphine et ses dérivés?

Une étude innovante a montré que l’administration par voie intraveineuse de nanomédicaments à base de Leu-enképhaline (LENK) couplée au squalène, un lipide endogène, présentait un effet antinociceptif prolongé dans un modèle de douleur inflammatoire chez le rat. NANOPAINKILL vise maintenant à répondre aux questions suivantes: Peut-on utiliser la même approche avec des inhibiteurs d’enképhalinases tels que l’opiorphine (OPN)? Peut-on améliorer l’activité antinociceptive avec des nanoparticules de LENK combinées aux OPN? L’administration de ces nanomédicaments par des voies autres que l'intraveineuse permet-elle d'obtenir un effet anti-nociceptif intéressant? Ces nanomédicaments sont-ils efficaces sur d’autres types de douleurs, telles que neuropathiques, post opératoires ou cancéreuses? L’utilisation des nanomédicaments à base de LENK et/ou OPN permet-elle réellement d’éviter des effets secondaires et une sensibilisation centrale comme c’est le cas avec la morphine et ses dérivés?

L'objectif est de cre´er de nouveaux outils permettant des mesures intracellulaires a` l'e´chelle du nanome`tre de la structure des prote´ines par double re´sonance e´lectronique pulse´e (PELDOR). Des acides amine´s classiques ou non-naturels (UAAs) seront utilise´s pour introduire dans des prote´ines des e´tiquettes de spin Mn(II) et Gd(III) paramagne´tiques, ge´ne´tiquement codables et capables d'auto-assemblage. Jusqu'ici, l'approche la plus courante a e´te´ de greffer des radicaux nitroxyde aux cyste´ines pre´sentes naturellement sur les prote´ines ou introduites par mutage´ne`se dirige´e. Cette approche a 4 inconve´nients majeurs : 1) l'usage de cyste´ines est proble´matique pour les prote´ines ayant de´ja` des cyste´ines importantes pour la structure ou la fonction; 2) la stabilite´ et la dure´e de vie des nitroxydes sont fortement diminue´es par le milieu cellulaire re´ducteur; 3) le marquage intracellulaire est tre`s difficile a` cause de l'encombrement du milieu; 4) les proprie´te´s magne´tiques des radicaux ne permettent pas d'exploiter la sensibilite´ supe´rieure des hauts champs magne´tiques. L'utilisation d'ions me´talliques stables et de UAAs permettra de surmonter ces inconve´nients. Nous exploiterons la biologie mole´culaire classique et les nouvelles techniques d'expansion du code ge´ne´tique pour introduire de manie`re cible´e des complexes prote´iques porteurs de fonctionnalite´s qui formeront des e´tiquettes paramagne´tiques a` l'inte´rieur des cellules. Cette approche e´vitera l'isolation et la modification post-translationnelle et permettra une de´tection dans la cellule, rendant inutiles les proce´dures invasives utilise´es actuellement pour introduire des prote´ines marque´es dans les cellules. La premie`re strate´gie de´veloppera l'utilisation de courtes se´quences aminoacide. Nous avons re´cemment montre´ que deux e´tiquettes de spin me´talliques peuvent e^tre ge´ne´tiquement introduites sur une me^me prote´ine, assemble´es et la distance les se´parant mesure´e dans la cellule sans intervention supple´mentaire (isolation, purification ou transformation chimique), ceci en introduisant des se´quences Lanthanide Binding Tags (LBT), puis par incubation de la culture cellulaire en pre´sence de Gd(III). Le Mn(II) fixe´ a` des e´tiquettes His-tag peut aussi e^tre utilise´ comme marqueur de spin en conditions cellulaires, malgre´ la faible affinite´ de ces e´tiquettes pour Mn(II). L'ajout de Mn(II) et Gd(III) au milieu de culture n'affecte ni la croissance cellulaire, ni l'expression prote´ique ni la survie. Nous optimiserons cette approche en ame´liorant la fixation, la flexibilite´ et les proprie´te´s spectroscopiques des marqueurs de spin me´talliques auto-assembleurs (SAMSL). La deuxie`me strate´gie utilisera des UAAs et l'expansion du code ge´ne´tique pour introduire de nouvelles fonctions chimiques. Une premie`re approche consistera a` incorporer un UAA pour introduire en un site spe´cifique d’une prote´ine (ou sur une prote´ine spe´cifique avec une localisation particulie`re dans la cellule) une ancre a` laquelle une e´tiquette de spin peut e^tre fixe´e. Ceci n’est pas possible avec des cyste´ines. La deuxie`me approche utilisera un UAA pour cre´er un site de fixation de me´taux qui peut e^tre utilise´ comme SAMSL, un His- tag ou LBT, mais plus versatile et compact. Des UAAs capables de fixer des me´taux ont de´ja` e´te´ introduits dans des prote´ines. En exploitant ces strate´gies plus flexibles de marquage de spin par des me´taux, nous ferons des e´tudes intracellulaires de l'organisation tridimensionnelle de la ge´phyrine, une prote´ine de l'e´chafaudage synaptique, ainsi que de ses interactions avec les inhibiteurs récepteurs de la glycine (GlyR). L'objectif a` terme est de produire une boi^te a` outils robuste d'introduction par codage ge´ne´tique de marqueurs de spin me´talliques qui e´largira le champ d'application de la PELDOR in vitro et rendra les mesures intracellulaires plus courantes.

En raison des effets pléiotropes des œstrogènes (E), la diminution de leur production par les ovaires à la ménopause entraîne souvent des symptômes climatériques (bouffées de chaleur et sueurs nocturnes, insomnie et instabilité de l'humeur) en raison de la baisse des E dans le système nerveux central (SNC). La privation en E peut également se manifester par une atrophie urogénitale, une redistribution abdominale des graisses et des modifications métaboliques, une accélération du vieillissement cutané et de l'ostéoporose. L'hormonothérapie (HT) est efficace pour prévenir les symptômes climatériques, ainsi que le risque d'ostéoporose, de diabète et de maladies coronaires. Cependant, l'HT augmente également 2 risques: celui de la thrombose veineuse (TV) et ses complications emboliques et celui de cancer du sein. Cela souligne la nécessité d’une optimisation de l’HT en conservant les principaux effets bénéfiques des E avec moins de risque de cancer du sein et/ou de TV. NOSE4 propose 2 nouvelles options pour optimiser la modulation du récepteur des estrogènes (ERa) dans une perspective d’HT: une nouvelle voie d'administration des E: intranasale et un nouvel œstrogène: l’Estetrol (E4). Il n'y a pas de consensus concernant la voie d'administration des E: orale aux USA, transdermique en France, cette dernière évitant un premier passage hépatique et donc l'augmentation des facteurs de coagulation et de risque de TV. Comme étudié dejà pour la progestérone et la testostérone (partenaires (P) 2 et 5), la voie d'administration intranasale de E pourrait permettre sa distribution préférentielle au SNC, renforçant les actions souhaitées (prévention des bouffées de chaleur, de la prise de poids et des anomalies métaboliques), tout en diminuant l'exposition du foie et des cibles sexuelles à l’E et, partant, les risques de TV et cancer du sein. Cette hypothèse sera testée dans la tâche 1. L’E4, un œstrogène synthétisé par le foie du fœtus, a récemment été évalué dans le cadre d’un essai clinique de phase II en tant que nouveau contraceptif oral par le P4). L’avantage de l’E4 par rapport aux autres E utilisés est que, jusqu'à 20 mg / jour, l’E4 n'a pas d'impact hépatique, en particulier sur les facteurs de coagulation, et pourrait donc ne pas augmenter le risque de TV. À la même dose, E4 contribue à inhiber l'ovulation tout en prévenant le spotting chez les jeunes femmes, et les bouffées de chaleur à la ménopause. L'objectif de la tâche 2 est d'élucider les mécanismes d'action de E4. ERa est un facteur de transcription qui présente une action nucléaire en se liant à la chromatine et en mobilisant des cofacteurs pour influencer la transcription de ses gènes cibles, mais une fraction de ERa liée à la membrane plasmique peut provoquer une signalisation rapide. Le P1 a précédemment démontré le profil unique de E4 : il active ERa nucléaire mais inhibe ERa membranaire. Nous émettons l'hypothèse que l'expression des gènes du foie dépend à la fois de l'ERa nucléaire et de ERa membranaire, et que le profil particulier de E4 pourrait expliquer son action «favorable au foie». Grâce à un ensemble unique de modèles de souris transgéniques, les P 1, 3 et 4 vont caractériser les mécanismes d’action moléculaires et cellulaires de E2 et E4 dans le foie. De plus, cette approche pourrait fournir un modèle pour comprendre l’un des mystères les plus intrigants de la biologie des ERa, à savoir la spécificité tissulaire des modulateurs sélectifs des ER. Ce projet sera mené par un consortium de 3 P académiques ayant une expertise reconnue dans la signalisation in vivo médiée par ERa (P1, INSERM Toulouse, coordinateur), la structure et la fonction de ERa et les mécanismes épigénétiques (P3, CNRS Rennes) et la synthèse et l’action des stéroïdes dans le SNC (P2, INSERM, Bicêtre). P4 (Mithra Pharma, Belgique) fournira au consortium l’E4 et P5 (M et P® Pharma AG, Suisse) développera les formulations des stéroides en gel pour l’administration intranasale.

La sclérose en plaques est une maladie neurologique auto-immune chronique du jeune adulte. Ses manifestations cliniques sont liées à une démyélinisation des fibres nerveuses du système nerveux central résultant de la destruction des oligodendrocytes. La perte des gaines de myéline conduit secondairement à une dégénérescence axonale, substrat de l’apparition d’un handicap irréversible. Bien que les traitements actuels, ciblant principalement le processus inflammatoire, présentent des effets bénéfiques en ralentissant la progression de la maladie, aucun d’entre eux n’a montré d’efficacité sur le long terme. Une stratégie alternative pour favoriser la neuroprotection est de stimuler les capacités endogènes de réparation de la myéline. Il a en effet été démontré, à la fois dans les modèles expérimentaux et dans les lésions de sclérose en plaques, que des cellules progénitrices d’oligodendrocytes, présentes dans le cerveau adulte, peuvent se différencier pour renouveler les gaines de myéline. Comprendre les différentes étapes qui conduisent ces cellules immatures à se différencier en oligodendrocytes myélinisants représente donc un enjeu fondamental pour élaborer de nouvelles thérapies. Nous abordons cette question en étudiant le rôle des signaux environnementaux qui contrôlent le développement des oligodendrocytes dans l’embryon et chez l’adulte après lésion de la myéline. Nos travaux ont largement contribué à identifier différents signaux impliqués dans l’initiation de la production des progéniteurs d’oligodendrocytes dans l’embryon mais également dans le contrôle de leur mobilisation aux sites de lésion chez l’adulte. Ces données, ainsi que celles apportées par la littérature, mettent en évidence l’existence d’une multiplicité de signaux qui favorisent ou, à l’inverse, inhibent la formation des gaines de myéline. L’enjeu actuel est donc de comprendre les mécanismes d’intégration de ces signaux dans le contrôle temporel de la différenciation des oligodendrocytes. Nos données récentes nous permettent de proposer que les protéoglycanes à héparane sulfate (PGHS), régulateurs clés de la communication de la cellule avec son environnement, pourraient jouer un rôle majeur dans la coordination de ces signaux. En effet, deux approches transcriptomiques, développées de manières indépendantes pour identifier des facteurs régulés au cours de la maturation des oligodendrocytes dans l’embryon ou chez l’adulte après lésion, ont révélé un ensemble de gènes codant pour des enzymes clés de la biosynthèse (Ndst1) et de la modification structurale (Sulf1/2) des PGHS. Ces enzymes, en établissant un profil de sulfatation spécifique sur les PGHS et ainsi leur affinité pour une large variété de signaux extracellulaires, représentent des éléments de régulation majeurs de la signalisation cellulaire. Notre but est d’élucider le rôle des PGHS dans la coordination des signaux qui contrôlent la maturation des oligodendrocytes. Notre stratégie est principalement basée sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés permettant de manipuler l'expression des enzymes de biosynthèse / modification des PGHS. Ce projet combine les expertises d’un consortium multidisciplinaire qui rassemble des spécialistes du développement embryonnaire et de la réparation dans des modèles animaux de démyélinisation. Cette complémentarité et un ensemble robuste de résultats préliminaires soutiennent la faisabilité de ce projet et son potentiel pour des avancées significatives dans la compréhension du contrôle de la myélinisation. Nos objectifs spécifiques sont de: 1) décrypter le rôle des PGHS dans la maturation des oligodendrocytes, 2) caractériser le mode d’action spécifique des PGHS (cellulaire autonome ou non-autonome) dans ce processus, 3) identifier les signaux de différenciation oligodendrocytaire dont l’activité est coordonnée par les PGHS, 4) élucider les mécanismes contrôlant la synthèse et la modification des PGHS au cours de la maturation des oligodendrocytes.