Oligo-Force-Sensor — Senseur de force pour mesurer l'oligomérisation des protéines membranaires

Contexte scientifique. L'oligomérisation de protéines membranaires est nécessaire pour la signalisation et le trafic dans les tissus sains ou malades. De nombreux travaux théoriques ont ?été?consacrés à déterminer les mécanismes physiques qui conduisent à ce processus, en particulier les interactions médiées par les membranes, mais très peu d'expériences ont permis de les tester quantitativement. Pour relever ce défi, nous avons conçu un nanosenseur de force basé sur la nanotechnologie ADN pour mesurer, pour la première fois, les forces développées lors de la formation de dimères et d'oligomères de protéines membranaires. Nous appliquerons ce nanosenseur à 2 systèmes complémentaires : i) la sous-unit? B de la toxine de Shiga (STxB), partie d'un agent pathogène humain qui se lie à son récepteur glycolipidique Gb3 à la membrane plasmique, et est utilisé comme outil pour l'administration d’immunomodulateurs pour l’immunothérapie anticancéreuse ; ii) Patched homolog 1 (Ptch1), une protéine transmembranaire de la voie de signalisation morphogène Hedgehog (Hh), dont l'activité de pompe à efflux du cholestérol et de médicaments contribue à la résistance à la chimiothérapie anticancéreuse. Principaux objectifs et méthodes du projet. Notre projet interdisciplinaire réunit des physiciens expérimentaux et théoriciens, des biochimistes et des chémobiologistes cellulaires pour : - Calibrer mécaniquement notre nanosenseur pour la mesure directe de forces entre protéines membranaires de l'ordre du pN (ligation ADN-protéine, transfert d'énergie de fluorescence par résonance en molécule unique (smFRET), microscopie interférentielle par diffusion (iSCAT), théorie). - Utiliser le nanosenseur étalonné pour mesurer les forces entre 2 molécules de STxB liées à la membrane, et leur variation avec la tension membranaire, la structure moléculaire du Gb3 et la machinerie cytosolique (aspiration par micropipette, synthèse chimique de glycolipides et reconstitution dans des membranes modèles ou des cellules). - L'utiliser pour mesurer, sur des membranes modèles ou cellulaires, comment les interactions entre 2 protéines Ptch1 sont modulées par leur ligand Hh, la composition lipidique de la membrane, la machinerie cytosolique ou par des petites molécules inhibitrices utilisées pour renforcer la chimiothérapie anticancéreuse (construction fonctionnelle de Ptch1 modifiée par un acide aminé non naturel, purification et reconstitution dans des vésicules unilamellaires géantes, ligation ADN-protéine sur membrane). Résultats attendus. Avec ce projet nous espérons développer un outil novateur en biophysique des membranes qui permettra de tester quantitativement les modèles théoriques sur l'oligomérisation des protéines et d'obtenir des conclusions solides sur les mécanismes sous-jacents. Notre nanosenseur sera le premier qui permette de mesurer directement des forces attractives entre protéines membranaires. Grâce à cet outil unique, nous espérons notamment démontrer que les forces induites par les fluctuations (de type "Casimir"), peu étudiées jusque-là, jouent un rôle clé dans l'oligomérisation. En outre, notre projet devrait permettre de trancher si les oligomères de Ptch1 préexistent ou non à la liaison de Hh et s'ils sont nécessaires à ses activités de transport du cholestérol et d'efflux de médicaments, indépendantes de Hh. D'autres protéines membranaires, telles que les récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs HER2 ou les récepteurs de cytokines, doivent aussi s'oligomériser pour permettre leurs fonctions de signalisation ; notre nanosenseur devrait donc ouvrir de nouvelles perspectives dans la recherche sur ces récepteurs, importants sur les plans physiologique et pathologique. De plus, la résistance aux médicaments conférée par l'expression de Ptch1 dans les tumeurs est un domaine d'intérêt croissant ; il existe donc un marché potentiel pour des outils comme notre nanosenseur de force pour résoudre ce challenge dans le traiteme