INSTITUT DES CELLULES SOUCHES POUR LE TRAITEMENT ET L'ETUDE DES MALADIES MONOGÉNIQUES

Le projet HUMANITY vise à comprendre les mécanismes physiopathologiques de la dystrophie myotonique congénitale (CDM), la forme la plus sévère de dystrophie myotonique de type 1. Cette pathologie se manifeste dès la naissance par une hypotonie musculaire et un retard du développement moteur. La CDM est causée par l’expansion de répétitions CTG dans le gène DMPK, entraînant la séquestration des protéines muscleblind-like (MBNL), essentielles à la régulation de l'épissage alternatif. Cette altération conduit à une immaturité des épissages embryonnaires, perturbant le développement neuromusculaire. Les études actuelles réalisées sur la CDM reposent principalement sur des biopsies de patients, fournissant une vision statique qui ne permet pas de capturer les processus dynamiques du développement musculaire et neuronal. Grâce aux avancées dans l’utilisation des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC), il est désormais possible de modéliser ces processus in vitro. En particulier, les organoïdes neuromusculaires (NMOs) permettent de recréer les interactions cellulaires complexes qui ont lieues au sein de la niche neuromusculaire, constituant ainsi un modèle physiologiquement pertinent pour l'étude de pathologies neuromusculaires. Nos travaux préliminaires ont permis de mettre au point un protocole robuste et reproductible pour générer des organoïdes neuromusculaires à partir de différentes lignées hiPSC. Ces organoïdes possèdent la capacité d’auto-organisation en compartiments distincts, neuronal et musculaire, et contiennent divers types cellulaires essentiels au développement du système neuromusculaire, notamment des motoneurones, des astrocytes et des cellules progénitrices musculaires caractérisées par l’expression du marqueur nucléaire PAX7. Après 100 jours de différentiation, des analyses en microscopie électroniques ont révélé la formation de contacts synaptiques entre neurones et fibres musculaires, ainsi qu’une organisation sarcomérique avancée, témoignant d’une maturation musculaire significative. Par ailleurs, le séquençage des organoïdes à l’échelle de noyaux uniques a confirmé la présence de nombreuses sous populations cellulaires, incluant des progéniteurs du neurectoderme, des neurones, des fibroblastes, et des cellules gliales. L’application de ce protocole sur des cellules hiPSC provenant de patients CDM a permis de générer des organoïdes pathologiques reproduisant les anomalies caractéristiques de la maladie. De plus, en différentiant différentes lignées CDM, ainsi que des lignées contrôles déplétées pour les différents isoformes de MBNL (MBNL KO), nos résultats ont démontré une diminution de la myogenèse associée à une diminution du nombre de cellules PAX7 positives à la fois dans les organoïdes CDM et dans les organoïdes MBNL KO. Ces résultats suggèrent que la perte de fonction des protéines MBNL contribue fortement aux défauts du développement musculaire observés dans la CDM. Ainsi, ce projet propose de modéliser les atteintes de développement du système neuromusculaire avec des organoïdes issus d’hiPSC de patients atteints de CDM. Les trois objectifs principaux sont : 1 - Élucider l'impact phénotypique et fonctionnel de la CDM et des protéines MBNL sur le développement neuromusculaire humain, 2 - Générer un atlas transcriptomique pour cartographier les altérations génétiques dans les cellules affectées par la CDM, ainsi que déterminer spécifiquement le rôle des protéines MBNL dans ces changements d’expression, et 3 - Évaluer les conséquences des transcrits les plus dérégulés sur le développement du système neuromusculaire. En combinant des modèles cellulaires avancés, des approches transcriptomiques de haute résolution et des outils d’édition du génome, ce projet a pour ambition non seulement d’approfondir notre compréhension des mécanismes physiopathologiques de la CDM, mais également d’ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques pour cette maladie invalidante pour les patients.

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est causée par une haploinsuffisance du gène NF1 codant la neurofibromine, un régulateur négatif des protéines RAS. La NF1 se caractérise par un large éventail de symptômes, notamment une hyperpigmentation cutanée, ainsi que des tumeurs bénignes des gaines des nerfs périphériques, appelées neurofibromes (résultant de la prolifération des cellules de Schwann). L'un des obstacles au progrès dans le traitement de la NF1 est son importante expressivité variable. Le type de variant pathogène de NF1 ne permet pas de prédire l'évolution clinique de la maladie. Par une étude d'association génome entier, nous avons récemment identifié des gènes modificateurs candidats, pour les anomalies de la pigmentation et les neurofibromes. Notre objectif est d'effectuer des validations fonctionnelles de ces gènes modificateurs candidats : 1. Dans un système in vitro de différenciation d’hiPSCs de patients NF1, en mélanocytes, nous ciblerons individuellement les gènes modificateurs candidats des lésions pigmentaires. Nous utiliserons ensuite diverses approches pour valider leurs effets fonctionnels. 2. Dans un test de compétition in vitro avec des cellules de Schwann humaines immortalisées, nous évaluerons l'impact fonctionnel de l’inactivation des gènes candidats modificateurs du développement des neurofibromes. Ce criblage permettra de réduire la liste des gènes candidats, pour ensuite les tester dans système in vitro de différenciation (depuis des hiPSCs NF1-déficientes vers des cellules de la crête neurale et des cellules de Schwann). Nous étudierons comment le ciblage des gènes modificateurs candidats par CRISPR/Cas9, à différents stades de la différenciation, influence l'identité des cellules de la crête neurale et la différenciation des cellules de Schwann. Ces résultats pourraient apporter un nouvel éclairage sur la pathogenèse de la NF1 et contribuer au développement d’une prise en charge stratifiée dans la NF1.

Les protéines se liant aux ARNs sont surreprésentées dans les facteurs associés aux troubles du spectre de l’autisme (TSA) et autres atteintes du neurodéveloppement. Ces protéines représentent des nœuds fonctionnels, dont les effets en cascade perturbent la régulation d’une myriade de gènes assurant des fonctions neuronales essentielles, notamment pendant le neurodéveloppement. Comprendre comment les protéines se liant aux ARNs sont régulées et agissent lors de la formation des réseaux neuronaux est essentiel pour comprendre la physiopathologie des NDD et proposer des stratégies thérapeutiques. Ce projet étudie les fonctions neuronales de SON, une protéine de liaison à l’ADN et à l’ARN. SON est un facteur essentiel à l’épissage de l’ARN dont la mutation provoque un syndrome neurodéveloppemental associé à des troubles autistiques. Le projet SPLICEUP mettra en lumière les interactions entre la régulation de l’ARNm et la connectivité corticale et fournira un éclairage mécanistique sur les conséquences d’une dérégulation des microexons, essentiels au développement neuronal, sur le développement et le fonctionnement synaptiques.

La réparation des lésions nerveuses dans le système nerveux périphérique (SNP) est un défi de taille en médecine régénérative. Les traumatismes, les maladies dégénératives et les interventions chirurgicales peuvent avoir des conséquences débilitantes pour les patients. Malgré les progrès réalisés en neurobiologie et neurochirurgie, les traitements actuels restent souvent limités dans leur capacité à promouvoir une régénération nerveuse efficace. Notre projet vise à combler cette lacune en développant un biomatériau électroactif innovant spécifiquement conçu pour stimuler la croissance axonale et favoriser la réparation des nerfs endommagés. Pour ce faire, nous adoptons une approche multidisciplinaire, réunissant des expertises en biologie cellulaire, en ingénierie des matériaux et en neurophysiologie. L'objectif principal est de comprendre les mécanismes sous-jacents de l'effet bénéfique d'un champ électrique local (CEL) sur la régénération nerveuse et d'appliquer ces connaissances à la conception d'un dispositif thérapeutique novateur. i) Phase 1 du projet : Caractérisation des Interactions Neurones-Substrat sous l'Influence du CEL Dans cette première phase, notre objectif est de comprendre en détail les interactions entre les neurones et le substrat électroactif en présence d'un CEL. Nous avons mis au point un dispositif expérimental original qui permet de contrôler précisément l'intensité du champ électrique appliqué et de visualiser en temps réel la croissance des neurites. Ce dispositif est hautement adaptable, ce qui nous permet d'incorporer des molécules bioactives favorisant la croissance axonale. Parallèlement, nous utilisons des techniques d'imagerie avancées telles que la microscopie à fluorescence et la microscopie électronique à balayage pour étudier les interactions cellulaires à l'interface neurone-substrat. Nous menons également des études biologiques approfondies pour caractériser les effets du CEL sur différents paramètres cellulaires, tels que l'élongation des neurites, l'adhésion neuronale et le couplage membrane-cytosquelette. En modifiant les propriétés adhésives, biochimiques et élastiques du substrat, nous visons à déterminer les conditions optimales pour favoriser la régénération nerveuse tout en minimisant les réactions inflammatoires et les phénomènes de rejet. ii) Phase 2 du projet : Développement d'un Prototype d'Implant Cylindrique Dans cette deuxième phase, nous envisageons de concevoir un prototype d'implant cylindrique intégrant les électrodes à un tube biocompatible et biorésorbable. Ce dispositif permettra d'appliquer de manière ciblée un CEL à la zone lésée, favorisant ainsi la régénération des fibres nerveuses. Nous prévoyons de tester ce prototype in vivo, en utilisant des modèles animaux de lésions nerveuses, afin de valider son efficacité et sa sécurité d'utilisation. iii) Résultats Attendus Nous anticipons que notre approche novatrice permettra une meilleure compréhension des mécanismes de régénération nerveuse et conduira au développement de stratégies thérapeutiques plus efficaces pour traiter les lésions nerveuses. Nous espérons démontrer que l'application d'un CEL peut stimuler la croissance axonale et améliorer la fonctionnalité des neurones régénérés. De plus, nous prévoyons que notre dispositif implantable sera bien toléré par l'organisme et capable de favoriser une régénération nerveuse significative chez les patients atteints de lésions nerveuses sévères. iv) Conclusion En conclusion, notre projet représente une avancée majeure dans le domaine de la régénération nerveuse en combinant des approches multidisciplinaires pour développer un biomatériau électroactif innovant. Nous sommes convaincus que nos travaux contribueront à améliorer la qualité de vie des patients souffrant de lésions nerveuses en offrant des solutions thérapeutiques plus efficaces et mieux adaptées à leurs besoins spécifiques.

L'altération du métabolisme de l'ARN est impliquée dans plusieurs maladies, notamment la dystrophie myotonique de type 1 (DM1). La DM1 est la maladie neuromusculaire héréditaire la plus fréquente de l'adulte, mais elle affecte des patients de tous les âges, des tissus et des types cellulaires variés. Elle s’accompagne d’une atteinte neurologique handicapante, dont les mécanismes restent méconnus. La pathologie moléculaire fait intervenir principalement une altération de l'activité des protéines MBNL, une famille de facteurs de liaison à l'ARN qui régulent l'épissage alternatif, la polyadénylation des ARN et le trafic intracellulaire des transcrits. Ces mécanismes, et notamment la distribution de l'ARN par domaines subcellulaires, sont essentiels pour la dynamique fonctionnelle des cellules du cerveau, y compris les astrocytes - un type cellulaire hautement ramifié. Nos travaux précédents montrent des anomalies importantes dans les astrocytes et suggèrent une composante non neuronale de la pathologie cérébrale de la DM1. Dans ce projet, nous étudierons l’impact des altérations des protéines MBNL1 sur la fonction astrocytaire dans la DM1, et comment ces anomalies conduisent à un dysfonctionnement du cerveau. Nous combinerons l'expertise multidisciplinaire de quatre partenaires et leurs modèles complémentaires de la maladie (souris transgéniques, cellules iPS et organoïdes). Nous analyserons la pathogenèse cérébrale par des techniques de transcriptomique, bioinformatique et imagerie. Nos résultats permettront d’élucider des aspects fondamentaux de la biologie des ARN dans les astrocytes, et corroboreront le rôle émergent des astrocytes dans l’étiologie des maladies neurologiques. Grâce à l'identification des voies moléculaires perturbées et au développement de nouveaux modèles murins et humains, notre recherche établira des connaissances solides et des outils de recherche pertinents pour répondre aux besoins thérapeutiques de la DM1.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA ou maladie de Charcot) est la troisième maladie neurodégénérative la plus commune en France. La SLA est caractérisée par une dégénérescence progressive des motoneurones conduisant à la paralysie musculaire, puis à la mort des patients en 2 à 5 ans. Il n’existe actuellement pas de traitement pour cette maladie. La cause la plus fréquente de SLA est une expansion de répétition des nucléotides GGGGCC dans le gène C9ORF72. Ces répétitions sont traduites en protéines DPR toxiques et diminuent l’expression de la protéine C9ORF72. Nos données récentes montrent que la perte d’expression de C9ORF72 diminue la capacité des neurones à éliminer par autophagie les protéine DPR, conduisant ainsi à la mort des neurones. De plus nous avons identifié des composés pharmaceutiques pouvant corriger ces altérations et rétablir une viabilité normale aux cellules (Sellier et al., 2016 ; Boivin et al., 2020). Nous souhaitons mieux comprendre ces mécanismes pathogéniques, notamment en résolvant la structure du complexe protéique contenant C9OR72 par cryoEM, mais aussi en développant de nouveaux modèles de neurones à partir de cellules humaines iPS et en créant de nouveaux modèle animaux (souris) de la sclérose latérale amyotrophique. De plus, nous souhaitons identifier des molécules pharmaceutiques pouvant corriger ces altérations, et ainsi explorer des pistes thérapeutiques pour cette maladie dévastatrice. En conclusion, ce projet novateur et ambitieux permettrait d’étudier les mécanismes moléculaires, cellulaires et physiologiques altérés dans une maladie génétique neurodégénérative, et ceci de façon intégrée, transversale et à de multiple échelle, allant de la structure atomique des protéines jusqu’à l’animal, et en passant par des cultures de neurones humains différenciés à partir de cellules IPS.

Les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) présentent des capacités immunorégulatrices étendues, modulant les immunités adaptative et innée par contact direct cellule-cellule, sécrétion de molécules et production de vésicules extracellulaires (VE). Nous avons observé préédemment que les CSM conditionnées (CSMc) par co-culture avec des cellules sanguines périphériques (PBMC) présentaient des effets immunomodulateurs accrus dans un modèle préclinique de la myasthénie (MG). Cette maladie neuromusculaire auto-immune est due à la production d'auto-anticorps dirigés contre la jonction neuromusculaire, et le thymus est fréquemment impliqué. Elle se caractérise cliniquement par une fatigabilité musculaire chronique et invalidante pouvant engager le pronostic vital. Les traitements immunosuppresseurs ont des effets secondaires sévères, ainsi une thérapie cellulaire basée sur les CSMc ou une thérapie acellulaire basée sur les VE dérivées des CSMc représenteraient des approches innovantes. Trois objectifs ont été définis en vue de perspectives cliniques. (A) Nous décrirons les mécanismes de conditionnement aux niveaux moléculaire et cellulaire et proposerons des marqueurs phénotypiques et fonctionnels des CSMc et de leurs VEs. (B) Nous identifierons les molécules solubles responsables du conditionnement pour les substituer à la co-culture avec les PBMC. (C) Nous comparerons l'efficacité immunomodulatrice des CSMc et de leurs VEs in vitro et in vivo. Cinq tâches ont été définies. (1) Nous identifierons les régulations d’expression géniques lors du conditionnement en utilisant l'analyse RNASeq. Cela soulignera les nouvelles voies immunomodulatrices utilisées, et permettra de proposer des protéines membranaires dérégulées comme nouveaux marqueurs. Une comparaison préliminaire de RNASeq entre CSM contrôles et conditionnées a montré une expression différentielle de 244 gènes. La validation de l'étude RNASeq sera réalisée par RT-PCR, cytométrie en flux et cytométrie de masse (CyTOF). Une étude CyTOF préliminaire a identifié des différences entre CSM contrôles et conditionnées. (2) Nous caractériserons les VE produites par les CSMc (taille, quantité, teneur en protéines, marqueurs membranaires, structure) en utilisant les méthodologies classiques et d’autres plus nouvelles (Cytoflex S, MACSPlex). (3) Nous évaluerons les capacités d'immunomodulation des CSMc et des VE in vitro en utilisant le test d'inhibition de prolifération des PBMC, l'analyse des changements dans les sous-populations de PBMC, et le dosage ELISA des protéines immunomodulatrices sécrétées. (4) En utilisant une approche protéomique (réalisée par la société Olink), nous avons identifié des protéines impliquées dans le conditionnement et nous allons évaluer, comparer, combiner leur efficacité à l'aide d'un criblage à moyen débit afin d’en définir une combinaison optimale. (5) Nous comparerons in vivo les efficacités des CSM conditionnées par les PBMC ou par la combinaison optimale de molécules, et de leurs VE, dans notre modèle murin humanisé. Ce modèle est établi en greffant des fragments de thymus MG dans des souris immunodéficientes. Les paramètres biologiques et cliniques seront suivis à l'aide d'outils classiques (test d’aggripement, comportement, grille inversée) et de nouveaux outils (électromyographie, exercice volontaire) afin de comparer, dos à dos, les potentiels de ces approches cellulaires et acellulaires. Le projet permet des collaborations originales entre des équipes de chercheurs académiques, de cliniciens, et un laboratoire de thérapie cellulaire qui partagent des expertises en production et caractérisation de cellules et de VE, en criblage, en physiopathologie. En explorant les mécanismes immunorégulateurs des CSMc et de leurs VE, ce projet aura des retombées scientifiques fondamentales, et l’étude de leurs effets dans un modèle de MG pourra ouvrir des perspectives d’utilisation dans d’autres maladies auto-immunes.

L'endocytose clathrine-dépendante est le processus le mieux caractérisé pour l'entrée des protéines et des lipides au niveau de la membrane plasmique des cellules eucaryotes. C'est aussi le talon d'Achille de la santé humaine puisqu’à l’origine de nombreuses maladies humaines telles que des maladies neurodégénératives et des myopathies. Alors que les neurones forment des puits de clathrine pour une endocytose rapide aux synapses, les cellules musculaires forment des plaques qui participent à l'adhérence cellulaire au niveau des costamères, pierre angulaire de la mécanotransduction de par leur rôle de lien entre la matrice extracellulaire et le cytosquelette. Nous avons montré que la formation de réseaux d'actine capables d’ancrer des filaments intermédiaires autour des plaques de clathrine nécessite la présence de la dynamine 2 (DNM2), un autre membre de la machinerie d'endocytose, crucial pour la formation et la libération des vésicules recouvertes de clathrine. Alors que des mutations de DNM2, de l'amphiphysine 2 (BIN1) et de la myotubularine (MTM1) sont responsables des formes dominantes et récessives de la myopathie centronucléaire (CNM), nous avons montré que les plaques de clathrine sont altérées dans les cellules de patients et les modèles de souris CNM. Nos résultats indiquent que cette altération est associée à des défauts dans la voie de mécanotransduction YAP/TAZ, conduisant à une transcription altérée de leurs gènes cibles. Le premier objectif de CLASS est de comprendre la fonction des plaques de clathrine dans la mécanotransduction des costamères et de mettre en évidence l'implication de sa dysfonction dans les CNM. Nous allons (1) analyser la réponse des plaques de clathrine aux signaux mécaniques, (2) disséquer la signalisation de la mécanotransduction dans la CNM et (3) établir l'effet bénéfique de la modulation de la voie YAP/TAZ sur des myotubes de patients CNM. Bien que nos résultats indiquent une fonction spécialisée pour les plaques de clathrine au niveau des costamères, une question fondamentale demeure: pourquoi certaines cellules forment-elles exclusivement des puits de clathrine alors que d'autres forment des plaques? Nous avons récemment obtenu la preuve de principe que la diversité et la plasticité des différentes structures de clathrine sont contrôlées par des événements d'épissage alternatif spécifiques aux tissus en montrant que l'épissage de l'exon 31 de la chaîne lourde de la clathrine contribue à la formation de plaques de clathrine dans les cellules musculaires. Nous avons montré une dérégulation de cet exon dans la dystrophie myotonique (DM1), une "spliceopathie" affectant en particulier les fonctions des muscles et du système nerveux central. Dans la DM1, la perte fonctionnelle de facteurs d'épissage entraîne une expression aberrante d’isoformes embryonnaires dans les tissus adultes. Le second objectif est de révéler les mécanismes par lesquels les cellules musculaires forment des plaques en utilisant des isoformes d’épissage de protéines de la machinerie de l'endocytose et de fournir de nouvelles pistes sur la physiopathologie de la dystrophie myotonique de type 1. Nous allons (4) révéler l'effet du saut d'exons clés des variants d'épissage de la clathrine, DNM2, BIN1 et PICALM dans les neurones et les myotubes en culture, (5) analyser l’effet des épissages anormaux de la machinerie d'endocytose dans les cellules de patients DM1 et (6) restaurer ces épissages anormaux dans des modèles murins de la DM1. Notre expertise dans le domaine de l'endocytose et la physiopathologie des CNM et de la DM1, notre savoir-faire dans la production de cellules pluripotentes induites humaines (hiPS) génétiquement modifiées et différenciées en neurones et en cellules musculaires, ainsi que notre expertise reconnue sur l'épissage des ARN, nous placent dans une position unique pour comprendre les déterminants qui régulent la plasticité structurelle de la clathrine dans le muscle sain et pathologique.

Les maladies neuromusculaires correspondent à un vaste groupe de troubles qui touchent collectivement 160 personnes sur 100000 dans le monde. Malgré des progrès récents, une grande partie de ces maladies sont toujours incurables. L’identification de nouveaux traitements est confrontée à la disponibilité d’outils de criblages pertinents ainsi que par la compréhension incomplète des mécanismes physiopathologiques, bien que les mutations et les gènes responsables de ces maladies aient été identifiés. En effet, à ce jour, le taux de réussite de produits thérapeutiques qui arrivent sur le marché est extrêmement faible. La plupart des candidats médicaments sont retirés à diverses étapes du processus de découverte et de développement pour des raisons d’innocuité ou de formulation, de mauvaises propriétés de l’ADME et de manque d’efficacité à la clinique. Plusieurs paramètres peuvent expliquer ce taux d’attrition élevé : (1). L’utilisation de modèles cellulaires non pertinents pour les campagnes de criblage pharmacologique ; (2). L’utilisation d’approches de découverte de médicaments ciblées dans lesquelles le point de départ est une cible moléculaire choisie pour jouer un rôle central dans la maladie. Cependant le rôle exact de ces cibles moléculaires n’est souvent pas bien compris dans le développement physiopathologique et ne prend pas en compte la complexité de ce développement. Par conséquent, l’un des défis essentiels pour l’identification de futures approches thérapeutiques réside dans l’établissement de modèles plus prédictifs et capable de saisir la complexité biologique de la maladie. Illustrant parfaitement ces limitations, la Dystrophie Myotonique de type 1 est l’une des formes les plus courantes de dystrophie musculaire chez l’adulte pour laquelle il n’existe aucun traitement curatife malgrè le fait que la mutation causale ait été identifiée il y a plus d’une trentaine d’années. Même si des pistes thérapeutiques ont été développées ces dernières années visant la présence de cette mutation, aucune n’a abouti actuellement démontrant l’intérêt de développer des modèles plus prédictifs capables de saisir la complexité biologique de la maladie. Dans ce contexte, le consortium TREAD propose de combiner l’utilisation de modèles cellulaires pertinents pour la pathologie avec une approche de criblage à large échelle basée sur de l’imagerie à haut contenu et de l’intelligence artificielle. De façon plus spécifique, TREAD vise à identifier des composés potentiellement thérapeutiques de par leur capacité à normaliser les défauts myogeniques observés chez les patients DM1 et qui peuvent être reproduits in vitro à l’aide de cellules musculaires. Le projet TREAD combinera l’utilisation de cellules souches humaines, porteuses de la mutation causale de cette pathologie, différenciées en cellules musculaires avec un criblage par imagerie à haut contenu basé sur des approches multiparamétriques et l’intelligence artificielle pour identifier de nouveaux traitements. Dans l’ensemble, notre proposition a plusieurs objectifs (1) identifier et optimiser de nouveaux composés capables de normaliser les défauts myogéniques associés au DM1, (2) déchiffrer leur mode d’action (3) valider leur action in vivo et (4) fournir une technologie de pointe qui accélérera le développement de thérapies pour la liste croissante de maladies neuromusculaires. Notre objectif final sera de convertir le meilleur candidat médicament identifié par cette approche en un produit applicable aux patients. En conclusion, notre proposition offre une occasion véritablement novatrice d’aller au-delà des limites des modèles actuels et promet d’ouvrir un nouvel espace majeur de développement d’essais en améliorant notre compréhension des mécanismes qui affectent le muscle squelettique DM1, d’identifier les modulateurs spécifiques à ces maladies musculaires d’origine génétique et d’offrir une plateforme pouvant être appliquée à un large éventail de domaines de recherche.

La neurofibromatose de type 1 (NF1) est une maladie rare (incidence de 1/3000 naissances) dûe à des mutations du gène NF1 qui prédisposent les patients à développer des tumeurs bénignes des gaines nerveuses appelées neurofibromes. Le gène NF1 code pour la neurofibromine (GTPase) dont la principale fonction est de réguler négativement l’activité de RAS. Les mutations de NF1 affectent directement la signalisation RAS-MAPK. L’altération de la voie de RAS-MAPK conduit à des maladies appelées les RASopathies dont NF1 fait partie. Les mutations de NF1 dans des cellules de Schwann entraînent le développement de neurofibromes cutanés (cNF), qui apparaissent généralement à la puberté et dont leur nombre augmente tout au long de la vie pour, dans certains cas, atteindre des milliers. Bien que de caractère bénin, les cNF défigurent et induisent souvent des démangeaisons et des douleurs, qui affectent de manière très importante la qualité de vie. Il n’existe à l’heure actuelle aucun protocole de prise en charge des patients pour limiter ou prévenir le développement des cNF. Dans le cadre d'un essai clinique récent, l'administration systémique d’un inhibiteur de MEK, le Selumetinib, à des enfants atteints de NF1 qui présentaient des NF plexiformes (atteintes nerveuses) non-opérables a montré une régression tumorale significative chez 70% des individus. En raison des effets secondaires sévères du Selumetinib, son utilisation pour traiter les cNF reste exclue et des approches plus efficaces et moins toxiques sont nécessaires. L'objectif de ce projet est de concevoir des nouveaux traitements pour les cNF. Ce programme de recherche comprend quatre parties complémentaires mais non interdépendants (WP1-4). Il est constitué d’un consortium de huit partenaires (P1-8), issus de cinq pays de l'UE, avec une grande expertise dans le criblage des molécules à haut débit, l'optimisation des molécules à usage médical, le développement de véhicules pour l'administration topique de médicaments, la génétique et les modèles animaux de NF1. P1 a développé un modèle murin unique Nf1-KO qui reproduit fidèlement la physiopathologie des lésions NF. Le WP1 sera dédié à l'évaluation de l'efficacité de deux nouveaux inhibiteurs de RAS, conçus par P2 (Boehringer Ingelheim, Autriche) pour bloquer le développement des cNF. Ces molécules seront administrées en topique par P1 (coordinateur, Inserm U955, France) aux souris Nf1-KO. Dans le WP2, P3 (EuLeadFactory, Pays-Bas) effectuera un criblage in vitro à haut débit d'une librairie de 50 000 composés en utilisant un système de culture de cellules tumorales isolées de NFs cutanés de souris mises au point par P1. Pour les composés les plus prometteurs (environ 50), les protéines cibles seront identifiées, puis la stabilité et la spécificité de l'inhibition de ces composés seront optimisées grâce à un pipeline de chimie médicale mise au point par P4 (CNRS 7311, France). L'efficacité des molécules issues de ce deuxième criblage sera évaluée au moyen d'un système de culture de cellules tumorales des NFc des patients par P6 (Espagne) et in vivo par P1 en utilisant les souris Nf1-KO. Des véhicules seront développés par P5 (ESPCI, France) pour permettre une application topique des inhibiteurs de RAS (WP1) et des nouveaux composés (WP2), Le WP3 sera consacré à l’évaluation de la thérapie génique pour compenser la mutation de Nf1 et prévenir le développement des NFc, chez les souris Nf1-KO. Le WP3 sera réalisé par P7 (Inserm U1051, France) pour optimiser le ciblage in vivo des cellules Schwann mutantes avec des vecteurs adénoviraux véhiculant le système d’expression de NF1. Enfin, le WP4 sera consacré à l'analyse multi-omique des cNFs issus des souris et de patients NF1 pour comprendre les mécanismes régissant leur développement et identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette dernière partie sera réalisée par P8 (Pologne) en collaboration avec P6 et P1.

Identification et caractérisation de nouvelles mutations génétique responsable de la sclérose latérale amyotrophique. La sclérose latérale amyotrophique (SLA, ou maladie de Charcot), est une maladie neurodégénérative dévastatrice caractérisée par la perte des motoneurones supérieurs et inférieurs, ce qui conduit à une atrophie et à une paralysie de l’ensemble des muscles squelettiques. La cause la plus fréquente de SLA est une expansion de répétition des nucléotides GGGGCC (G4C2) dans le gène C9ORF72. Nous avons montré que la perte d’expression de C9ORF72 conduit à la mort neuronale dans des modèle de poisson zèbre (Ciura et al., 2013), et que la fonction de C9ORF72 est de réguler l’autophagie (Sellier et al., 2016), c’est-à-dire l‘élimination d’agrégats de protéines toxiques pour les neurones. Récemment, nous avons identifié de nouvelles mutations faux sens dans le gène C9ORF72. Ces mutations sont trouvées spécifiquement chez des patients atteints de SLA, et sont absente de cohorte d’individus contrôles ou de banque de données génétiques contrôles. L’étude de ces mutations par transfection de cellules neuronale ou par injection dans des poissons zèbres montre que ces mutations altèrent l’autophagie et conduisent à la mort des neurones. Nous souhaitons donc mieux comprendre comment ces mutations sont toxiques, notamment en développant des modèles cellulaires iPS et animaux de SLA. De plus, nous souhaitons identifier des molécules pharmaceutiques pouvant corriger les altérations dues aux mutations de C9ORF72. Nos objectifs sont donc les suivants : 1 – Etablir des modèles cellulaires iPS et animaux (poisson zèbre et souris) de ces mutations. 2 – Comprendre comment ces mutations altèrent l’autophagie. 3 – Comprendre la relation entre ces mutations et l’expansions G4C2 dans C9ORF72. 4 – identifier des composés pharmacologiques pouvant rétablir une autophagie normale et corriger l’effet de ces mutations. En conclusion, ce projet permettrait de mieux comprendre les causes à l’origine de la SLA, une étape indispensable pour établir des stratégies thérapeutiques pour cette maladie dévastatrice.

Le projet Parkington vise à proposer une nouvelle approche de thérapie cellulaire pour le traitement des maladies neurodégénératives, en particulier pour la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington (MP et MH). Au cours de la dernière décennie, les cellules souches pluripotentes ont fourni un accès sans précédent aux types de cellules humaines. Ceci est particulièrement vrai des neurones du système nerveux central, étant évidemment inaccessibles par biopsie. La possibilité de générer des lignées cellulaires isogéniques spécifiques aux patients, ou des banques de lignées cellulaires de donneurs immunocompatible couvrant presque toute la population mondiale ouvre de nouvelles perspectives pour une thérapie cellulaire personnalisée. Les neurones destinés à remplacer les neurones dysfonctionnels ou mourants étaient issus jusqu'à récemment de fœtus avortés ou de lignées de cellules dérivées de carcinome embryonnaire. Aucune de ces sources n’est compatible avec une thérapie cellulaire à grande échelle. La disponibilité de lignées de cellules souches humaines pluripotentes associées au développement de protocoles très efficaces générant des cellules neuronales spécifiques in vitro une variété constitue une étape importante pour surmonter les problèmes éthiques et logistiques susmentionnés. Cependant, en plus de la source cellulaire, il existe une autre limitation empêche la greffe neuronale humaine d’être la stratégie poursuivie par les essais cliniques. La greffe de neurones matures conduit à un taux de survie médiocre en raison de leur sensibilité au détachement et de la fragilité des extensions neuritiques. Une alternative consiste à greffer des précurseurs neuronaux avec l'espoir d'une maturation appropriée in situ. Bien que cette méthode soit largement plebiscitée, elle ne permet pas un bon contrôle de l'identité neuronale in situ et comporte un risque tumoral. Dans le projet de Parkington, nous proposons que la greffe d'organoïdes neuronaux de taille et de contenu cellulaire contrôlé pourrait contourner cette limitation. P # 1 (E. Bezard) est un expert reconnu dans la recherche translationnelle sur les maladies neurodégénératives et dirige une équipe qui se focalise sur la maladie de Parkinson. Le consortium interdisciplinaire construit par P # 1 est composé de 3 autres groupes complémentaires. L'équipe de biophysique de P # 2 (P. Nassoy) a développé la Technologie de Capsules Cellulaires (TCC). La TCC permet l'encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines dans des capsules d'hydrogel creuses et la production de tissus neuronaux de taille contrôlée. L'équipe de P # 3 (A. Perrier) a développé des protocoles pour générer à la fois les neurones dopaminergiques nigraux perdus dans la MP et des neurones GABAergiques striataux perdus dans la MH à partir de cellules souches pluripotentes humaines. L'équipe de P # 4 (A. Gaillard) a démontré que les cellules neurales greffées peuvent récapituler leurs connections physiologiques, en particulier dans le contexte de la reconstruction de la voie nigro-striée dans la MP. Les données préliminaires obtenues grâce à un travail collaboratif local entre P # 1 et P # 2 ont posé les bases du projet. La validation de notre approche jusqu'à un stade préclinique implique des efforts synergiques entre tous les partenaires pour générer et caractériser les "Organoïdes Neuronaux Contrôlés" (ONCs) et évaluer les résultats comportementaux de la greffe d’ONC. Nous sommes convaincus que ce projet démontrera le potentiel de cette approche dans les modèles animaux de la MP et la MH. Cela favorisera l’application de cette technologie dans des études précliniques et ultimement la thérapie cellulaire humaine. Le projet Parkington a pour ambition de proposer une solution thérapeutique qui soit une véritable alternative au traitement médicamenteux symptomatologique à la fois pour la MP et la MH.