UMR3348 - Intégrité du génome, ARN et cancer

Les changements dans la structure chromosomique appelés réarrangements chromosomiques complexes (GCRs pour Gross Chromosomal Rearrangements, ex : translocations ou amplifications) sont des moteurs fondamentaux des processus évolutifs mais aussi une caractéristique majeure des cellules cancéreuses et des troubles neurologiques. Le stress de réplication qui provient de problèmes dans la progression des fourches de réplication est une des principales sources de GCRs. Le lien entre stress de réplication et GCRs est indéniable et pourtant les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'occurrence de GCRs induits par des stress de réplication sont loin d'être complètement élucidés. Ici, je propose un projet visant à approfondir notre compréhension des mécanismes par lesquels les GCRs sont induits par des stress de réplication. Pour cela, deux essais génétiques innovants en cours de développement chez la levure de fission et dans les cellules humaines seront utilisés pour étudier de manière non biaisée les GCRs induits par des stress de réplication. De plus, le rôle du positionnement nucléaire dans la formation de GCRs induits par le stress de réplication sera abordé pour la première fois de manière systématique. L'adaptabilité de ces systèmes génétiques offre une opportunité unique d'étudier un large éventail de sources de stress de réplication et leur impact sur les GCRs qui en résultent. La réalisation de ce projet contribuera à fournir, à court et à long terme, une meilleure caractérisation des voies moléculaires sous-jacentes à l'évolution des génomes ou encore à des évènements pathologiques tels que la tumorigénèse.

La condensation mitotique des chromosomes (CMC) est la réorganisation globale des fibres de chromatine en chromosomes métaphasiques, en préparation à leur ségrégation précise en anaphase. Condensine est le moteur moléculaire de la CMC. Les données actuelles indiquent que condensine se lie massivement et directement à l’ADN au moment de l’entrée des cellules en mitose et façonne les chromosomes mitotiques en extrudant l’ADN génomique en boucles de chromatine. Comment condensine opère in vivo et dans quelle mesure la chromatine doit être remodelée pour accueillir condensine demeurent mal compris. La condensation des chromosomes est maximale en mitose mais nous ignorons à quelle phase du cycle cellulaire exactement les chromosomes se préparent à une telle condensation. De nombreux travaux montrent l’existence d’un couplage entre la réplication de l’ADN et la CMC, mais dont les bases moléculaires demeurent inconnues. Un rôle pour condensine dans la réplication du génome constituerait un lien direct avec la CMC, mais aucun rôle pour condensine dans la réplication n’a été décrit à ce jour. En utilisant la levure S. pombe comme modèle, nous avons découvert que condensine prend part à la réplication de l’ADN en phase S. Nous avons trouvé un lien physique entre condensine et la machinerie de réplication et identifié des mutants spécifiques de condensine qui altèrent la réplication de l’ADN. Nous observons une séparation génétique des fonctions réplicatives et mitotiques de condensine, suggérant deux fonctions distinctes. Nos résultats suggèrent également que la fonction de condensine dans la réplication prépare les chromosomes pour la CMC. Les objectifs de ce projet sont (1) de caractériser au niveau moléculaire le rôle exact joué par condensine dans la réplication et (2) comment cette fonction réplicative promeut la CMC lors de la mitose suivante. Les données à disposition pointent vers un rôle de la chromatine réassemblée dans le sillage des fourches de réplication.

Microtubules (MT) are core components of the eukaryotic cytoskeleton with essential roles in cell division, cell shape, intracellular transport, and motility. Despite their functional divergence, MTs have highly conserved structures made from almost identical molecular building blocks – tubulin proteins. A variety of posttranslational modifications (PTMs) diversifies these building blocks, which is thought to control most of the properties and functions of the MT cytoskeleton, a concept referred to as the ‘tubulin code’. While they appear to have subtle effects at the molecular level, tubulin PTMs are essential for maintaining cellular functions of MTs over large spatial and temporal scales. Yet, a comprehensive knowledge of the principles of the tubulin code, connecting its functions across the molecular, cellular and organismal levels, is almost entirely lacking. Our project aims to obtain a novel molecular and mechanistic understanding of how tubulin PTMs control long-term cellular function and homeostasis. Our unique approach bridges all relevant scales of biology and relies on a synergy between our powerful experimental models and expertise in biochemistry, structural biology, single-molecule assays, systems-biophysics, cell biology, and physiology. Specifically, we will: (1) Determine how different tubulin PTMs affect biophysical and structural properties of MTs and their interactions with associated proteins; (2) Define the impact of tubulin PTMs on overall MT cytoskeleton behaviour and the resulting physiological implications in neurons; (3) Combine zebrafish and mouse models and develop a novel fish model for lifelong in-vivo imaging to determine how the tubulin PTMs control lifelong MT-based functions. Our work will define the importance of tubulin PTMs by revealing their critical molecular functions over the lifetime of an organism. The project has the potential to substantially change our perception of the cytoskeleton’s role in homeostasis and disease.

RNA-binding proteins (RBPs) are critical regulators of gene expression programs. They regulate all aspects of RNA life, including transcription, splicing, modification, localization, stability, translation and decay, and consequently, perturbations in these RBP-RNA networks underlie the origin of many diseases. Recent proteomics-based studies have vastly expanded the repertoire of RBPs to the thousands, uncovering unconventional RBPs such as metabolic enzymes ‘moonlighting’ in RNA-binding activity or RNAs “riboregulating” protein function. This represents a much broader layer of biological control that was previously envisaged, which adds an entirely new dimension to RBP-dependent regulation of cellular homeostasis. RBP-ReguNet has been conceived to leverage these new discoveries to identify druggable targets for a range of untreatable diseases, including cancer, neurological disorders, liver diseases and infectious disease. Our ambition in RBP-ReguNet is to create a high-level training program based on basic research but with a strong impact on clinical translation. RBP-ReguNet will provide advanced multidisciplinary scientific training that spans from computational, structural, molecular and cellular biology to medicinal chemistry and pharmacological screening, to the next generation of European researchers in an intersectoral environment to pursue ambitious and high gain research on the development of new therapies based on RBP biology. They will be trained in a range of core and state-of-the-art discipline-specific research skills, complementary transferable skills, and entrepreneurial skills by secondments to non-academic partners, with a common focus to discover actionable targets. This network of excellence will push the boundaries of knowledge in the protein-RNA interactions universe, and at the same time provide the next generation of students with the skills to become future leaders in the field.

L'épissage alternatif en permettant d'augmenter le répertoire des ARNm a un impact direct sur la fonction des protéines et donc sur le contrôle du destin cellulaire. De nombreuses données soulignent l’importance des modifications chromatiniennes qui favorisent ou défavorisent l'inclusion d'un exon alternatif. Le variant d'histone H2A.Z participe au contrôle de l'expression des gènes et de la stabilité génétique. Cependant, un certain nombre de données publiées ou préliminaires suggèrent que H2A.Z participe également au contrôle de processus liés à l'élongation de la transcription et au traitement des pré-ARNm. Notre objectif est donc d'étudier la fonction des deux isoformes humaines H2A.Z.1 et H2A.Z.2, qui constituent ensemble la H2A.Z humaine, dans la régulation de l'épissage. Plus précisément, nous (i) évaluerons l'impact sur l'épissage de la déplétion de l'expression de H2A.Z.1 et/ou H2A.Z.2 à l'aide d'un dégron ; (ii) étudierons le mécanisme impliqué, en testant le rôle des isoformes H2A.Z dans le recrutement des facteurs d'épissage et dans le contrôle de la vitesse de l'ARN polymérase (Pol) II ; et (iii) testerons si les mécanismes identifiés ci-dessus sont importants pour l'engagement dans un destin cellulaire. Ce projet sera abordé par le groupe de Didier Trouche, un leader dans la fonction de H2A.Z et le groupe de Reini Luco, une pionnière dans l'étude du rôle de la chromatine dans la régulation de l'épissage alternatif. Ce projet, basé sur de solides données préliminaires, bénéficiera d’un ensemble de données uniques sur l'occupation des isoformes H2A.Z que nous avons générées. Nous effectuerons une déplétion rapide et robuste des isoformes H2A.Z à base d'auxine suivi d’une analyse par les techniques up-to-date des changements dans l'épissage, du recrutement des facteurs d'épissage et de la vitesse de l'ARN pol II, ce qui permettra une compréhension unique de la fonction de H2A.Z dans le contrôle épigénétique de l'épissage chez les mammifères.

Les cellules sont continuellement soumises à des contraintes mécaniques. Pour maintenir leur homéostasie, elle module leur propriété mécanique. Néanmoins, ce processus est gourmand en énergie. Par conséquent, les cellules reprogramment leur métabolisme pour ajuster leurs besoins énergétiques à leur environnement mécanique. Ces observations définissent l'axe mécano-métabo comme moteur moléculaire de l'architecture tissulaire. Récemment, nous avons démontré que le catabolisme mécano-induit de la glutamine favorise la glutamylation des microtubules, modulant ainsi les propriétés mécaniques des cellules. Néanmoins, la glutamylation ne se limite pas à la tubuline, et les mécanismes permettant aux cellules de moduler leur état mécanique restent largement inconnus. Nos données préliminaires indiquent que plusieurs protéines liées au métabolisme de la glutamine sont glutamylées en réponse à la rigidification de la matrice. Par conséquent, nous émettons l'hypothèse que la glutamylation des protéines liées au métabolisme de la glutamine module leur fonction/localisation/activité et ainsi ajuste l’activité de l’axe mécano-metabo, permettant aux cellules de s'adapter à leur environnement mécanique. Pour élucider le rôle de la glutamylation des protéines dans le contrôle mécanique des cellules, nous proposons un projet transdisciplinaire qui s'appuie sur trois avancées conceptuelles et techniques majeures présentes dans nos laboratoires : 1) la démonstration par le partenaire 1 (P1) que les forces mécaniques reprogramment le métabolisme cellulaire ; 2) la démonstration par P2 que la glutamylation module la fonction/localisation/activité des protéines ; 3) l'expertise unique de P3 dans les approches protéomiques permettant l'identification de la glutamylation. Plus précisément, nous visons à déterminer comment la rigidité de la matrice module la glutamylation des protéines (Aim 1), et si et comment la glutamylation des protéines modifie l'axe mécano-métabo (Aim 2)

Les modifications post-transcriptionnelles, les variants et les protéines de liaison aux histones constituent, en plus de la séquence des gènes, une information qui contribue à la régulation de l'accessibilité de l'ADN, et à la programmation de l’identité cellulaire. Le remodelage de la chromatine au cours des métabolismes de l'ADN, comme la réplication, la réparation et la transcription, peuvent compromettre ces domaines chromatiniens et menacer l'identité cellulaire. Ce type de dommage épigénétique contribue souvent à de mauvaise évolution de tumeurs, l’apparition des maladies du vieillissement ou l’aggravation d’infections virales. Le dépôt des histones sur l'ADN est facilité par une famille de protéines appelées chaperons d'histones, qui les escortent et assurent également un couplage avec d'autres processus tels que la réplication/réparation de l'ADN ou la transcription des gènes. Le dépôt des histones H3-H4 est assuré in vivo par deux voies distinctes selon qu'il est couplé ou non à la synthèse de l'ADN. Alors que plusieurs chaperons ont déjà été identifiés pour le dépôt des histones H3-H4 indépendant de la synthèse de l'ADN, un seul chaperon est connu à ce jour pour favoriser le dépôt des histones H3-H4 dans le contexte de la synthèse de l'ADN, le Chromatin Assembly Factor 1 (CAF-1). CAF-1 est un complexe conservé au cours de l'évolution comprenant trois sous-unités. Malgré son rôle biologique central, aucune structure du complexe entier n'a été rsolue. La plus grande sous-unité, centrale pour la formation du complexe, est la moins conservée (21% d'identité entre la levure et l’homme). Sa structure, comprend plusieurs régions prédites comme désordonnées. De façon remarquable, la protéine de la levure S. pombe est plus courte et moins désordonnée. L'objectif du projet CAFinDS est d'élucider les mécanismes moléculaires associés au dépôt des histones par CAF-1. Pour ce projet, nous nous appuierons sur l'expertise des quatre partenaires, ainsi que sur un ensemble de données préliminaires solides, pour élucider les mécanismes d'action de CAF-1 mieux définir son action pendant la réplication et la réparation par recombinaison homologue. Les études fonctionnelles bénéficieront d’informations structurales sur CAF-1 et son mode d’interaction avec les acteurs essentiels de ces voies. L'implication de CAF-1 dans la différenciation cellulaire sera également explorée grâce à des mutants perturbant sa reconnaissance spécifique pour les variants des histones réplicatives (données préliminaires). Notre hypothèse est que la plasticité structurale de CAF-1 et des histones, impliquant un ensemble d'interactions compétitives/coopératives et des changements conformationnels, est essentielle pour le permettre le dépôt des histones par CAF-1 sur l’ADN. Nous entreprendrons donc des études structurales intégrant des informations provenant de régions ordonnées et non structurées de CAF-1 et explorerons les changements de conformation possibles lors de la liaison des histones et de l'ADN. Le consortium est idéalement positionné pour répondre à ces objectifs, il réunit des équipes reconnus pour leur expertise dans les études structurales dédiées aux facteurs de la chromatine et dans la biologie de l'assemblage du nucléosome et de l'impact des caractéristiques chromatiniennes/épigénétiques sur la stabilité, la réplication et la réparation du génome. Les études cellulaires incluront des approches génétiques et de biologie cellulaire dans des lignées pertinentes de souris et humaines, ainsi que chez la levure S. pombe. Les résultats obtenus apporteront une vision intégrée du mécanisme d'action de CAF-1. Cette connaissance est non seulement d'un intérêt fondamental mais également importante pour notre compréhension des dérégulations des états épigénétiques observés dans de nombreuses maladies, y compris les cancers, les infections virales, mais également dans le vieillissement et les maladies neurodégénératives.

Les traitements de la colite ulcéreuse (CU) se sont considérablement améliorés ces dernières années, mais de nombreux patients ne répondent pas ou développent des résistances. Il y a donc un besoin urgent de développer de nouvelles approches thérapeutiques guidées par des biomarqueurs. Les cils primaires (CP) sont un important centre de signalisation des cellules, et nous avons été les premiers à identifier leur rôle dans le côlon. Notamment, nous avons trouvé un défaut de cils primaires dans les régions enflammées des biopsies de patients de CU. Maintenant nous caractériserons (1) les cellules du côlon exprimant ces cils et (2) les altérations moléculaires qui résultent de leur perte, par des approches de protéomique et RNAseq sur des modèles murins. Enfin, nous vérifierons si les cils primaires et les mécanismes identifiés peuvent servir de biomarqueur sur les biopsies de patients atteints de CU.

Peu de gènes sont impliqués dans les dysgénésies thyroïdiennes (DT) à l’origine de l’hypothyroïdie congénitale (HC) touchant 1/3000 nouveau-nés. Récemment, nous avons identifié un nouveau gène TUBB1 impliqué dans les HCDT. TUBB1 code pour un isotype de ß-tubuline, un des éléments constitutifs des microtubules (MT), et fortement représenté dans les plaquettes. Nous avons montré qu’une altération des MT pouvait perturber le développement thyroïdien et l’activation des plaquettes. Nous émettons l'hypothèse que d'autres composants du cytosquelette, tels que les autres isoformes de tubuline et leurs modifications post-traductionnelles pourraient affecter le développement et la physiologie de la thyroïde, ainsi que la fonction des plaquettes. Notre projet élucidera cette hypothèse en analysant l’organisation des MT et leurs mécanismes dans le développement de la thyroïde, la sécrétion des hormones thyroïdienne et la fonction des plaquettes via des modèles in vivo et in vitro déjà établis.

L'activation de la voie NF-kB s’accompagne d’une régulation coordonnée de la transcription de centaines de gènes cibles, la majorité étant impliquée dans la différenciation cellulaire, la prolifération, la réponse immunitaire, et l'inflammation. Il a été récemment proposé que des structures nucléaires appelées usines à transcription NF-kB coordonnent, dans l’espace et le temps, la transcription de plusieurs gènes répondeurs à NF-kB. Cependant, les mécanismes moléculaires mis en jeu dans ces contacts gène-gène, ainsi que leurs impacts sur d'autres processus couplés à la transcription restent inconnus. L'infection par HTLV-1 (Human T-cell Leukemia Virus type 1) s’accompagne d’une activation constitutive de NF-kB qui contribue à l'expansion clonale des cellules infectées, la persistance virale, et la pathogenèse. Nos travaux ont récemment mis en évidence que, en dehors de la transcription, l'activation de NF-kB par la protéine virale TAX affecte également l'épissage alternatif, un processus cotranscriptionnel majeur dans la diversité du transcriptome et du protéome. En présence de TAX, ou même d'autres activateurs non viraux de NF-kB, nous avons démontré que l’enrichissement intragénique de RELA entraîne un recrutement local du facteur d'épissage DDX17 qui régule l'épissage des exons par à son activité hélicase à ARN. De manière intéressante, RELA apparait réguler l'épissage alternatif de manière indépendante de son activité sur la transcription, ce qui pose la question des mécanismes de coordination de ces deux fonctions de RELA lors de l'activation de NF-kB par TAX, ou par d’autres stimuli non-viraux. Via une analyse intégrative de la topologie 3D de la chromatine et des profils d'expression des gènes, nos données préliminaires indiquent que l'activation du NF-kB par TAX favorise les contacts gène-gène entre les gènes subissant une régulation de la transcription et de l'épissage alternatif. La perturbation locale des contacts gène-gène par manipulation épigénétique permettait d’inhiber le recrutement de DDX17 à l'exon et son épissage alternatif. Au niveau de la chromatine, les contacts gène-gène étaient enrichis en RELA, DDX17 et TAX, suggérant l’engagement de ces facteurs dans la formation de complexes multigéniques. Les analyses de données publiques montrent que les exons génomiques régulés par RELA:DDX17 portent des signatures épigénétiques qui pourraient participer à coordonner les contacts gène-gène, l'élongation de la transcription, et l'épissage alternatif lors de l'activation de NF-kB. Ces premières données proposent que l'épissage alternatif ne repose pas uniquement sur des caractéristiques génomiques et épigénétiques locales de l'exon cible, mais dépend également de sa localisation nucléaire avec d'autres gènes co-régulés en transcription. Nous avons mis en place une collaboration entre nos deux équipes sur la base de l’expertise du HTLV-1 et de ses impacts sur les régulations post-transcriptionnelles (F. Mortreux), et celle des mécanismes qui relient l'épigénétique à la régulation de l'épissage alternatif (RF. Luco). Nos objectifs sont d'évaluer la distribution chromatinienne de RELA, DDX17, TAX et des marques d'histones dans les contacts gène-gène liés à l'épissage alternatif, d'examiner l'implication locale des régulateurs d'histones et des protéines d’architecture de la chromatine, et d'étudier les relations causales qui relient les contacts gène-gène et les marques d'histones à l'épissage alternatif survenant lors de l'activation de NF-kB par TAX ou d’autres inducteurs non viraux. Ces données informeront sur les modes de coordination spatiale de la transcription des gènes et de l'épissage alternatif lors de l'activation de NF-kB, qui est un aspect mal compris de la régulation des gènes lors de l'infection par HTLV-1 et, de manière plus générale, dans les maladies inflammatoires.