IntpTN3 — IntpTN3, une recombinase unique, RecA-inépendante et dirigée par l'homologie: mécanisme, structure, partenaires et applications

Nous avons publié récemment la découverte d'une nouvelle integrase (IntpTN3) codée par un plasmide provenant de l’archée anaérobie hyperthermophile Thermococcus nautili. En plus de ses propriétés canoniques d'intégration, d'excision et d'inversion spécifiques de site, cette recombinase à tyrosine présente des activités sans précédent. IntpTN3 est responsable de la génération d'un nombre d’inversions chromosomiques à grande échelle in vivo, chez son hôte naturel T. nautili. Nous avons reproduit avec succès ces inversions dans un système purifié in vitro exposant ainsi les propriétés très inhabituelles de recombinaison homologue (RH) de cette enzyme. IntpTN3 est capable de promouvoir des réactions de RH entre toute paire de segments d'ADN de séquence identique aussi courts que 100pb. La RH cellulaire est un mécanisme essentiel et complexe qui se produit dans chaque organisme; elle nécessite de l'énergie, un certain nombre de complexes de protéines et de processus coordonnés tels que la synthèse d'ADN. Contrairement à la RH cellulaire, la RH promues par IntpTN3 ne nécessite que l'enzyme et son substrat d'ADN: elle peut être obtenue efficacement dans le tube à essai. Le présent projet vise à décrypter les mécanismes moléculaires de la recombinaison par IntpTN3 afin d'améliorer nos connaissances fondamentales de la RH et d'utiliser ces connaissances pour développer de nouvelles applications biotechnologiques. Le projet suivra trois approches complémentaires: (1) La première approche concerne l'exploration du ou des composants protéiques de la réaction HR in vitro. Nous avons caractérisé plusieurs intégrases hyperthermophiles RH et non-RH. En échangeant des domaines et en générant des enzymes mutantes, nous visons à dissocier les deux activités de recombinaison et à découvrir les domaines impliqués dans la RH. La résolution de la structure tridimensionnelle d’IntpTN3, seule ou avec des substrats d’ADN, sera déterminante pour la détermination du mécanisme moléculaire précis de la RH par IntpTN3. Comme les recombinases nécessitent souvent un facteur secondaire pour une activité complète, nous utiliserons des technologies de pointe pour détecter et identifier d'autres partenaires protéiques impliqués dans la RH par IntpTN3. (2) Dans la seconde approche, nous explorerons le composant ADN de la réaction RH in vitro. Dans un certain nombre de rapports, des mécanismes moléculaires observés in vivo impliquent l'appariement de régions chromosomiques avec une séquence d'ADN similaire ou identique et se produisent en absence de rupture de l'ADN. Il a été suggéré que des structures particulières telles que l'ADN paranémique (PX-ADN) se forment par appariement homologue, mais les preuves formelles font encore défaut. En conduisant les réactions HR à complétion, IntpTN3 permettra d’étudier in vitro pour la première fois la topologie des substrats d’ADN impliqués dans ces mécanismes fondamentaux. (3) Les approches précédentes contribueront à mieux comprendre mais également à améliorer la réaction RH in vitro catalysée par IntpTN3. Nous proposons une preuve de concept basée sur ces connaissances qui ouvre la voie au développement de nouvelles technologies pouvant être utilisées pour la manipulation de chromosomes ou la thérapie génique. Des résultats préliminaires spectaculaires ont été obtenus depuis le début de ce projet et nous prévoyons d’autres données essentielles et des avancées importantes qui seront publiées dans des revues scientifiques à fort impact. Certains aspects originaux de cette recherche visent à générer des applications industrielles et seront protégés par brevet par nos tutelles.