NOSTIME — Nouveaux analogues photoactivables de NADPH pour le suivi spatio-temporel de flavoenzymes

L’objectif de ce projet est de développer de nouveaux outils photoactivables pour isoler et déclencher un processus catalytique spécifique par impulsion laser. Cette impulsion laser fixe le temps zéro, et permet de synchroniser l’initiation de l’événement catalytique dans un ensemble de protéines natives en solution. Actuellement, des molécules cagées constituées d’une partie active (cofacteur, ligand) et d’un groupement photolabile sont utilisées pour contrôler le démarrage d’une réaction enzymatique, l’impulsion laser servant à la photo-déprotection de la partie active. Cependant, le temps de diffusion de la partie active jusqu’à la protéine cible peut être trop long, donc inadapté pour des études résolues dans le temps de protéines avec un cycle catalytique rapide. Notre projet représente une nouvelle approche pour synchroniser un ensemble de protéines en solution, en utilisant une molécule photoactivable directement liée à la protéine, capable de déclencher la catalyse par injection ultrarapide d’électrons à la protéine après impulsion laser. Ce projet est centré sur l’utilisation de nouveaux analogues photoactivables de NADPH, nommés nanotrigger (NT), ciblant le site de fixation de NADPH des NO synthases (NOS) et de la cytochrome P450 réductase (POR) afin de stabiliser ces enzymes dans une conformation propice à la cristallisation. Ce projet permettra de (1) déterminer la structure aux rayons X des complexes NT-protéines; (2) élucider le mécanisme des premières étapes catalytiques des NOS et POR réductases à l’échelle moléculaire par des études cinétiques en solution; en parallèle, des études réalisées sur des cristaux de complexes NT-protéines permettront de « visualiser » à une résolution atomique, par cristallographie aux rayons X résolue dans le temps, les premières étapes catalytiques et les changements conformationnels leurs étant associés; (3) sur la base des structures des complexes, il sera possible de concevoir de nouveaux activateurs spécifiques de l’isoforme eNOS par modélisation moléculaire et de les synthétiser; (4) les propriétés intrinsèques d’imagerie de fluorescence des NTs et leur spécificité permettront, à l’échelle de cellules endothéliales vivantes, de suivre le trafic de l’enzyme eNOS par excitation biphotonique. Le processus de photoactivation réalisé par NT s’inspire de la photosynthèse: il implique un changement du potentiel redox de la molécule active (NT lié à la NOS) par absorption d’un ou de deux photons, induisant un transfert d’électrons à la protéine. Ce concept ouvre des perspectives, notamment dans le domaine de la photosynthèse artificielle. De plus, la capacité de déclencher sélectivement l’activité d’enzymes telles que eNOS, impliquée dans la dysfonction endothéliale, ouvre aussi de nouvelles options thérapeutiques dans le traitement de maladies telles que l’hypertension, le diabète, et certains processus neurodégénératifs. NOSTIME est un projet multidisciplinaire de recherche fondamentale, établissant de nouvelles collaborations internationales entre la France et les Etats Unis. Le partenariat français aux compétences multiples en synthèse organique (J. Xie), en modélisation moléculaire et en biophysique (A. Slama-Schwok), en fluorescence résolue dans le temps et en imagerie biphotonique (E. Deprez), est associé à un partenariat américain complémentaire expert en biochimie et en structure de NOS et P450 (L. Roman and J.J. Kim). Drs. Roman et Kim sont des collaboratrices de longue date dans les études de NOS. La synergie des partenaires en enzymologie des NOS, en cristallographie aux rayons X et la disponibilité d’instrumentation de pointe pour la cristallographie résolue dans le temps jointe au savoir-faire des équipes françaises en synthèse, modélisation et biophotonique rassemble en un seul consortium toutes les expertises nécessaires à la réalisation de ce projet, un atout majeur pour garantir le succès de ce projet.