NOBLEACH — Contrôle du photoblanchiment des protéines fluorescentes pour la microscopie super-résolution.

Les techniques de microscopie de fluorescence jouent un rôle croissant en sciences du vivant. Ces dernières années, le développement le plus spectaculaire a concerné la microscopie super-résolution (nanoscopie), qui permet d'obtenir des images à une résolution d'environ 20 nm. Rendant possible l'observation de la cellule vivante à l'échelle de macromolécules individuelles, la nanoscopie ouvre un vaste champ de recherche, intégrant biologie structurale et biologie cellulaire. Il est pressenti que la technique, bien qu'encore immature, aura un impact majeur en médecine et santé humaine. Les méthodes de nanoscopie par localisation de molécules uniques (PALM/STORM) sont les plus polyvalentes et les plus prometteuses. Elles sont presque entièrement fondées sur la manipulation des propriétés photophysiques des marqueurs fluorescents, typiquement des sondes photoactivables pouvant être activées sélectivement d'un état éteint à un état allumé au moyen d'une illumination laser adéquate. Les protéines fluorescentes (FPs) photoactivables de la famille GFP sont ainsi des acteurs fondamentaux en microscopie PALM. Ces dernières années nous avons acquis une expertise reconnue dans le domaine de la photophysique des protéines fluorescentes. Nous avons développé et caractérisé de nouvelles FPs photoactivables en utilisant une combinaison de cristallographie cinétique, spectroscopie in cristallo, et modélisation, dans le contexte de notre précédent projet ANR "DSPF". Un problème majeur des FPs concerne leur grande susceptibilité au photoblanchiment, ie, leur perte rapide et non réversible de fluorescence suite à leur illumination. Le problème du photoblanchiment affecte pratiquement toutes les techniques de microscopie de fluorescence et limite sérieusement la résolution atteignable en nanoscopie PALM. Pourtant, les mécanismes qui gouvernent le photoblanchiment chez les FPs restent largement méconnus. Nous proposons ici d'étendre notre recherche sur les protéines fluorescentes à la question du photoblanchiment, afin de caractériser les mécanismes impliqués, de comprendre le rôle de facteurs environnementaux (potentiel redox, pH, oxygène), et de mettre au point des variants photorésistants. Photoblanchiment et photoactivation étant intimement liés, nos études combineront l'analyse des deux phénomènes. Nous utiliserons une vaste palette de techniques allant du monocristal jusqu'à la molécule unique. Les réactions impliquant des transferts de charge (électron, proton), au cœur des mécanismes de photoblanchiment, seront étudiées en détail. En plus d'études à l'échelle moléculaire effectuées par cristallographie, spectroscopie optique et modélisation, nous donneront une grande importance aux investigations sur molécules uniques in vitro et in cellulo. Des cellules "tests" nous permettront de valider les performances de nos protéines fluorescentes pour l'imagerie PALM. Nous tenterons de proposer des variants mis au point de façon rationnelle, possédant des propriétés de photoactivation et de photoblanchiment améliorées. En plus de servir le développement de la microscopie super-résolution et d'améliorer notre connaissance de la photophysique des protéines fluorescentes, cette recherche fondamentale pourrait trouver des applications en biotechnologie et mener au développement de nouveaux senseurs. Ce projet sera conduit dans le cadre d'une nouvelle équipe de recherche appelée "Pixel". Cette équipe lie d'une manière unique deux instituts grenoblois, l'IBS et l'iRTSV, avec le but de développer la microscopie de fluorescence super-résolution à la frontière entre la biologie structurale et la biologie cellulaire. Ce projet accompagne un élargissement majeur des activités du coordinateur vers l'imagerie et la biologie structurale intégrée. La position stratégique de l'équipe Pixel sera idéale pour que les résultats de notre recherche bénéficient directement à la communauté de biologie cellulaire.