Aspects métaboliques et systémiques de l’oncogenèse pour de nouvelles approches thérapeutiques (

L'électrochimiothérapie est fréquemment utilisée dans les tumeurs primaires ou métastatiques. Cependant, les taux de réponse clinique restent améliorables. S. Bekeschus (INP, Greifswald, Germany) and C Brenner (CNRS, Villejuif, France) ont identifié que le glutathion (GSH) permet la mort des cellules cancéreuses induite par l'électroporation à des taux élevés et inattendus in vitro. Notre stratégie vise à élucider les mécanismes et la pertinence translationnelle des résultats. Il s'agit notamment de tester sept lignées cellulaires malignes et une lignée cellulaire non maligne, la cinétique et les mécanismes de la mort cellulaire, le rôle de l'auto-amplification des ROS et les profils immunogènes et immunosuppresseurs des cellules électroporées au GSH. Outre les tests effectués sur des cultures 2D et des sphéroïdes tumoraux 3D, des tumeurs 3D vascularisées et génératrices de matrice seront testées dans le modèle TUM-CAM in ovo. En outre, un modèle de souris syngénique exprimant de façon stable la luciférase permettra l'imagerie par bioluminescence in vivo. Le modèle permet de disséquer le rôle du système immunitaire dans la réduction tumorale médiée par l'électroporation du GSH en déchiffrant l'infiltration leucocytaire intratumorale et l'état d'activation cellulaire dans les ganglions lymphatiques (modèle récemment mis en place avec succès dans le laboratoire de S. Bekeschus, subvention de la Stiftung Tumorforschung Kopf-Hals). L'utilisation du GSH, injecté par voie intratumorale, constituerait une approche pratiquement sans effets secondaires, avec des implications révolutionnaires pour les thérapies d'électroporation oncologiques. Bénéficiant d'une forte complémentarité et opérant dans des centres internationaux de recherche en oncologie de premier plan, notre consortium pourra être en mesure de proposer de nouveaux mécanismes d'action fondamentaux du GSH-PEF et des protocoles à faibles effets secondaires qui pourraient rapidement être transférés en clinique.

L’ambition du projet ESCAPADE initial était de développer de nouvelles briques technologiques pouvant intéresser tout à la fois la défense pour la neutralisation d’engins explosifs improvisés (IED) ou pour la perturbation de cibles électroniques et, également, plusieurs domaines applicatifs civils dont le secteur médical. Pour le secteur civil et plus spécifiquement le domaine médical, nous ambitionnons, dans ce programme ESCAPADE 2, de développer deux démonstrateurs basés sur des technologies distinctes : - L’une est envisagée pour des applications médicales de surface, c’est-à-dire des traitements cutanés ou sous cutanés (cancer de la peau notamment), - L’autre, à partir d’un dispositif induisant une focalisation du champ électrique dans une zone d’intérêt à quelques centimètres de profondeur, pour le traitement de tumeurs profondes ou difficilement accessibles dans des organes tels le foie, le cerveau ou la colonne vertébrale. Le point commun entre ces deux dispositifs est qu’ils mettent en œuvre des générateurs impulsionnels hautes tensions de durée subnanosecondes dont l’enjeu est de produire une électroperméabilisation des cellules sans contact à partir de ces impulsions ultra courtes. Pour le secteur Défense, le projet ESCAPADE 2 a pour vocation de comparer les effets produits sur des cibles électroniques par deux sources impulsionnelles de forte puissance : une source Bande Ultra Etroite (BUE) développée par la société ITOPP et une source Ultra Large Bande (ULB), objet du projet ESCAPADE initial. Il s’agira, pour chacune d’entre elles, de mener une réflexion poussée sur les aspects opérationnels en vue d’une utilisation future de ces sources (fiabilité, robustesse, consommation électrique, refroidissement des composants, maintenance, etc…). De plus, la source électromagnétique ULB fera l’objet d’une montée en niveau de maturité technologique avec des efforts particuliers portés sur le générateur de Marx et sur l’antenne unitaire de puissance. Les performances de ces deux équipements délivrant des formes d’ondes très différentes seront évaluées, et des essais de vulnérabilité seront conduits en chambre anéchoïque au CEA Gramat, sur des cibles génériques. Il pourra s’agir, d’ampoules flash représentatives de détonateurs d’engins explosifs improvisés comme dans le projet ESCAPADE initial, de PC, de réseaux informatiques, de caméras, de détecteurs de présence, de systèmes de communication 5G ou de drones par exemple.

La prévention de nombreuses maladies menaçant la santé au niveau mondial exige la recherche de nouveaux vaccins. Le développement de vaccins modulables basés sur des pseudo-particules virales est limité par la difficulté de greffage des antigènes (Ag) à leur surface. Nous avons conçu un nouveau vecteur d'Ag basé sur la reconnaissance moléculaire entre des pseudo capsides recombinantes du bactériophage T5 (Capsid-Like-Particles ou CLP) et sa protéine de décoration pb10. Nous exploitons la modularité de pb10 pour produire des chimères pb10-Ag qui se fixent avec une forte affinité à la surface des CLP. Ce mode de greffage irréversible permet d'obtenir des CLP exposant un réseau régulier d’Ag de grande taille. L’immunisation de souris avec l'Ag modèle ovalbumine a démontré que les CLP constituent des vecteurs d'Ag hautement immunogènes et auto-adjuvants, ouvrant de nouvelles perspectives en vaccination. CALIPSO propose de développer ce nouveau type de vaccin pour répondre à des problèmes de santé publique, dans un cadre prophylactique ou thérapeutique. Des vecteurs CLP-Ag seront produits pour induire des réponses immunitaires contre le rotavirus (RV) et le virus du papillome humain (HPV), deux pathogènes nécessitant de nouveaux vaccins. Nous analyserons si les réponses immunitaires induites par les CLP présentant des Ag de surface du RV ou des Ag oncogènes du HPV permettent d’induire une immunité protectrice contre le RV ou de contrôler les tumeurs induites par HPV. L’utilisation de méthodologies analytiques de pointe permettra une évaluation rapide de l'intégrité des CLP et de l'efficacité de greffage des Ag, critères clés pour la validation de futurs vaccins. Le consortium CALIPSO regroupe des experts en biologie des phages, immunologie et méthodes d’analyse de nanoparticules. En démontrant la capacité des vecteurs CLP-Ag à contrer des menaces de santé publique, nous visons une technologie innovante pour le développement rapide de nouveaux vaccins.

La plupart des cellules vivantes présente une différence de potentiel électrique de part et d’autre de leur membrane plasmique résultant de différences de concentration en ions maintenues par des canaux et pompes ioniques. La membrane d’un neurone peut être soudainement (˜1 ms) dépolarisée (son potentiel intracellulaire passant de -70 mV à +30 mV) par l’ouverture synchronisée de ces canaux, stimulée par d’autres neurones, engendrant alors un « potentiel d’action » qui se propage jusqu’aux autres cellules auxquelles ce neurone est connecté par des synapses. Le suivi de cette dépolarisation renseigne ainsi sur la transmission synaptique, essentielle aux processus cognitifs et neuromoteurs. L’approche classique consiste à mesurer l’activité électrophysiologique à l’aide de micropipettes sur quelques cellules à la fois (« patch-clamp »), ou avec un réseau de microélectrodes enregistrant alors les potentiels extracellulaires d’un ensemble de neurones. Depuis quelques décennies, des méthodes de mesures optiques ont été introduites pour obtenir simultanément l’activité électrique d’un grand nombre de cellules simultanément avec une grande résolution. En dehors de quelques travaux exploitant la modulation d’effets électroplasmoniques de nanoparticules d’or ou de charges de nanocristaux semiconducteurs, ces méthodes présentent un certain nombre d’inconvénients (photoblanchiment, toxicité…) ou de limites quant à la mesure d’un signal électrophysiologique extracellulaire. L’objectif de notre projet est de développer et valider biologiquement une nouvelle sonde photoluminescente du potentiel extracellulaire s’appuyant sur un mécanisme de transduction encore jamais exploré pour cette application et qui devrait aboutir à une très grande résolution spatiotemporelle. Ces sondes sont des nanocristaux ferroélectriques (NCFE) dopés avec des ions de terres rares (RE3+) dont nous détecterons la modulation spectrale de conversion ascendante de photons (up-conversion, UC) en fonction du potentiel électrique environnant. Les variations de ce potentiel, sous l’effet de l’ouverture des canaux ioniques, modifient la densité surfacique des charges de polarisation P du NCFE, faisant alors varier P qui entraine à son tour une déformation du NCFE par effet piézoélectrique inverse, induisant enfin un changement d’intensité de certaines raies d’émission d’UC. Ce processus est conforté par notre récente observation d’une telle modulation de l’UC dans un NCFE exposé à un champ électrique. Tout d’abord, nous synthétiserons des NCFE de BaTiO3 de taille˜200 nm dopés avec des ions d’Er3+ et Yb3+ et testerons également d’autres matrices à réponse piézoélectrique plus forte, et d’autres dopants. Des calculs ab initio nous aideront à déterminer les sites cristallographiques les plus favorables pour l’incorporation des ions. Nous caractériserons l’intensité de l’UC et sa durée de vie. Ensuite, nous imagerons les domaines ferro/piezoélectriques de NCFE individuels par microscopie à force piézoélectrique (PFM) où un potentiel oscillant est appliqué à la pointe. Nous chercherons à produire des NCFE brillants monodomaines. Nous quantifierons la variation du spectre d’UC lors des mesures PFM, ainsi que sous le flux d’ions issu d’une pointe à décharge. Enfin, nous testerons la capacité des NCFE à détecter des changements de densités de charges en solution, avant de les utiliser, après biofonctionalisation, comme capteurs optiques de changements de potentiel proche des membranes lors d’une électroporation, puis pour suivre la régénérescence nerveuse. Ce projet fortement interdisciplinaire requiert les compétences complémentaires de cinq équipes, en synthèse et caractérisation de NCFE, spectroscopie optique et microscopie à sonde en champ proche, bio-conjugaison de nanoparticules et en bioélectrochimie. Ce projet exploitant les charges de polarisation de nanosystèmes ferroélectriques permettra d'ouvrir un nouveau champ d'applications au-delà de celui biomédical.

La plupart des cellules vivantes présente une différence de potentiel électrique de part et d’autre de leur membrane plasmique résultant de différences de concentration en ions maintenues par des canaux et pompes ioniques. La membrane d’un neurone peut être soudainement (≈1 ms) dépolarisée (son potentiel intracellulaire passant de -70 mV à +30 mV) par l’ouverture synchronisée de ces canaux, stimulée par d’autres neurones, engendrant alors un « potentiel d’action » qui se propage jusqu’aux autres cellules auxquelles ce neurone est connecté par des synapses. Le suivi de cette dépolarisation renseigne ainsi sur la transmission synaptique, essentielle aux processus cognitifs et neuromoteurs. L’approche classique consiste à mesurer l’activité électrophysiologique à l’aide de micropipettes sur quelques cellules à la fois (« patch-clamp »), ou avec un réseau de microélectrodes enregistrant alors les potentiels extracellulaires d’un ensemble de neurones. Depuis quelques décennies, des méthodes de mesures optiques ont été introduites pour obtenir simultanément l’activité électrique d’un grand nombre de cellules simultanément avec une grande résolution. En dehors de quelques travaux exploitant la modulation d’effets électroplasmoniques de nanoparticules d’or ou de charges de nanocristaux semiconducteurs, ces méthodes présentent un certain nombre d’inconvénients (photoblanchiment, toxicité…) ou de limites quant à la mesure d’un signal électrophysiologique extracellulaire. L’objectif de notre projet est de développer et valider biologiquement une nouvelle sonde photoluminescente du potentiel extracellulaire s’appuyant sur un mécanisme de transduction encore jamais exploré pour cette application et qui devrait aboutir à une très grande résolution spatiotemporelle. Ces sondes sont des nanocristaux ferroélectriques (NCFE) dopés avec des ions de terres rares (RE3+) dont nous détecterons la modulation spectrale de conversion ascendante de photons (up-conversion, UC) en fonction du potentiel électrique environnant. Les variations de ce potentiel, sous l’effet de l’ouverture des canaux ioniques, modifient la densité surfacique des charges de polarisation P du NCFE, faisant alors varier P qui entraine à son tour une déformation du NCFE par effet piézoélectrique inverse, induisant enfin un changement d’intensité de certaines raies d’émission d’UC. Ce processus est conforté par notre récente observation d’une telle modulation de l’UC dans un NCFE exposé à un champ électrique. Tout d’abord, nous synthétiserons des NCFE de BaTiO3 de taille≈200 nm dopés avec des ions d’Er3+ et Yb3+ et testerons également d’autres matrices à réponse piézoélectrique plus forte, et d’autres dopants. Des calculs ab initio nous aideront à déterminer les sites cristallographiques les plus favorables pour l’incorporation des ions. Nous caractériserons l’intensité de l’UC et sa durée de vie. Ensuite, nous imagerons les domaines ferro/piezoélectriques de NCFE individuels par microscopie à force piézoélectrique (PFM) où un potentiel oscillant est appliqué à la pointe. Nous chercherons à produire des NCFE brillants monodomaines. Nous quantifierons la variation du spectre d’UC lors des mesures PFM, ainsi que sous le flux d’ions issu d’une pointe à décharge. Enfin, nous testerons la capacité des NCFE à détecter des changements de densités de charges en solution, avant de les utiliser, après biofonctionalisation, comme capteurs optiques de changements de potentiel proche des membranes lors d’une électroporation, puis pour suivre la régénérescence nerveuse. Ce projet fortement interdisciplinaire requiert les compétences complémentaires de cinq équipes, en synthèse et caractérisation de NCFE, spectroscopie optique et microscopie à sonde en champ proche, bio-conjugaison de nanoparticules et en bioélectrochimie. Ce projet exploitant les charges de polarisation de nanosystèmes ferroélectriques permettra d'ouvrir un nouveau champ d'applications au-delà de celui biomédical.