Interactions cellules souches niches: physiologie, tumeurs, réparations tissulaires

L'hémorragie est l'une des principales causes décès évitable chez les militaires au combat. Actuellement, la majorité des patients reçoit des composants sanguins (globules rouges, plaquettes, plasma) plutôt que du sang complet. Le sang total présente l'avantage de simplifier la logistique de la réanimation, de fournir des ratios physiologiques de composants, de réduire les volumes de conservation et de permettre la transfusion de plaquettes et globules rouges plus jeunes. Cependant c’est un produit qui n’est pas utilisé en médecine civile en France, même s’il l’est déjà aux Etats-Unis. Ces éléments conduisent les médecins déployés en opération extérieure (OPEX) à utiliser du plasma, des CGR et des plaquettes. Or, les concentrés plaquettaires peuvent ne pas être disponibles en mission, leurs conditions de conservation et leur durée de vie n’étant pas toujours compatible avec la logistique des OPEX. Ainsi, seule l’utilisation du sang total déleucocyté de groupe O sans hémolysine (ou Low Titer O Whole Blood, LTOWB), amenant les trois éléments dans les proportions physiologiques, permet de répondre à cette problématique. Cependant, si des études ont montré l’efficacité de ce produit pour arrêter le saignement, son potentiel inflammatoire, lié à la présence des plaquettes, n’a pas encore été investigué. Outre leur rôle hémostatique, les plaquettes sont également impliquées dans l'inflammation, notamment en libérant de nombreuses molécules immunomodulatrices. L’objectif principal de notre projet de recherche s’intéresse à déployer des outils in vitro et in vivo pour caractériser des produits sanguins labiles (PSL) innovants, dont le LTOWB, transfusés en médecine civile et militaire se concentrant sur la composante inflammatoire de ces PSL. Le développement d'outils in vitro et in vivo pour définir des biomarqueurs est essentiel pour optimiser l’utilisation de ces PSL, selon l’indication thérapeutique. Mettre en relation ces biomarqueurs avec l'efficacité des transfusions constituera une aide à la décision sur le rapport bénéfice/risque des transfusions qui peuvent intervenir dans les environnements ruraux et austères, tels qu’en OPEX. Nous souhaitons donc caractériser différents produits plaquettaires, notamment le LTOWB, selon deux approches, in vitro et In vivo: i) Dans l’approche in vitro, nous quantifierons les facteurs inflammatoires solubles et les microvésicules, libérés par les plaquettes de LTOWB, et nous évaluerons les processus d’activation, d’apoptose, d’autophagie des plaquettes ainsi que leur métabolisme respiratoire. Nous analyserons également la capacité des plaquettes à promouvoir l’inflammation au travers de leurs interactions avec les cellules endothéliales et les neutrophiles. Ces différents paramètres plaquettaires seront analysés en fonction du processus de préparation et de la durée de stockage des différents produits plaquettaires. ii) Dans l’approche in vivo, nous évaluerons le rendement transfusionnel de produits plaquettaires humains caractérisés in vitro et transfusés dans un modèle de souris immunodéficientes (NSG) en situation de thrombopénie induite ou d’hémorragie massive. Les éventuelles complications thrombotiques seront aussi évaluées. Cette étude aura un impact majeur sur les pratiques de soins de santé dépendant des PSL dans le contexte très spécifique de la médecine militaire, notamment en OPEX. Ce projet reflète notre volonté de structurer un consortium INSERM-EFS-CTSA, en capacité de mutualiser les compétences et technologies adaptées aux questions de développement et d'évaluation des PSL pour des applications en médecine civile et/ou militaire. Il nous permettra également de positionner l’EFS et le CTSA, en collaboration renforcée, à l'international, dans un domaine très compétitif au regard du dynamisme des activités de recherche des services militaires de transfusion (notamment américains).

Les mitochondries sont des organites qui forment le noyau du métabolisme énergétique mais elles sont également impliquées dans la régulation du métabolisme intermédiaire, l'apoptose, l'immunité innée et la régulation calcique. Des défauts dans les protéines mitochondriales et/ou un dysfonctionnement mitochondrial affectant le système musculaire, métabolique, neurologique ou immunitaire sont responsables de nombreuses pathologies chez l’homme. Les cellules doivent donc s'adapter rapidement aux stress environnementaux qui affectent la fonction mitochondriale. De fait, différentes formes de communication mitonucléaire sont impliquées dans les modifications de l'expression des protéines codées à la fois par les génomes mitochondriaux et nucléaires en réponse à divers facteurs de stress ou pour préserver l'homéostasie. Récemment, il a été rapporté qu'un axe OMA1-DELE1-HRI est impliqué dans l'initiation d'une réponse intégrée au stress (RIS) après un stress mitochondrial, pour permettre l'expression de gènes cytoprotecteurs spécifiques qui reprogramment et renouvellent le métabolisme cellulaire vers la synthèse des principaux métabolites. Cependant, cet axe OMA1-DELE1-HRI n'a été exploré que dans des lignées en culture qui utilisent principalement la glycolyse plutôt que les mitochondries pour produire de l'énergie contrairement aux tissus tels que les muscles où la production d'énergie dépend largement des mitochondries. Il existe donc un besoin urgent d'explorer le rôle physiologique de cet axe OMA1-DELE1-HRI dans la RIS médiée par les mitochondries in vivo, notamment dans le muscle, et de mieux caractériser ses modes spécifiques de régulation et d'activation. C'est ce que nous proposons de réaliser dans ce projet. Ainsi, nos résultats fourniront de nouvelles informations sur les mécanismes impliqués dans la restauration de l'homéostasie cellulaire suite à un stress mitochondrial.

Les cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) présentent des capacités immunorégulatrices étendues, modulant les immunités adaptative et innée par contact direct cellule-cellule, sécrétion de molécules et production de vésicules extracellulaires (VE). Nous avons observé préédemment que les CSM conditionnées (CSMc) par co-culture avec des cellules sanguines périphériques (PBMC) présentaient des effets immunomodulateurs accrus dans un modèle préclinique de la myasthénie (MG). Cette maladie neuromusculaire auto-immune est due à la production d'auto-anticorps dirigés contre la jonction neuromusculaire, et le thymus est fréquemment impliqué. Elle se caractérise cliniquement par une fatigabilité musculaire chronique et invalidante pouvant engager le pronostic vital. Les traitements immunosuppresseurs ont des effets secondaires sévères, ainsi une thérapie cellulaire basée sur les CSMc ou une thérapie acellulaire basée sur les VE dérivées des CSMc représenteraient des approches innovantes. Trois objectifs ont été définis en vue de perspectives cliniques. (A) Nous décrirons les mécanismes de conditionnement aux niveaux moléculaire et cellulaire et proposerons des marqueurs phénotypiques et fonctionnels des CSMc et de leurs VEs. (B) Nous identifierons les molécules solubles responsables du conditionnement pour les substituer à la co-culture avec les PBMC. (C) Nous comparerons l'efficacité immunomodulatrice des CSMc et de leurs VEs in vitro et in vivo. Cinq tâches ont été définies. (1) Nous identifierons les régulations d’expression géniques lors du conditionnement en utilisant l'analyse RNASeq. Cela soulignera les nouvelles voies immunomodulatrices utilisées, et permettra de proposer des protéines membranaires dérégulées comme nouveaux marqueurs. Une comparaison préliminaire de RNASeq entre CSM contrôles et conditionnées a montré une expression différentielle de 244 gènes. La validation de l'étude RNASeq sera réalisée par RT-PCR, cytométrie en flux et cytométrie de masse (CyTOF). Une étude CyTOF préliminaire a identifié des différences entre CSM contrôles et conditionnées. (2) Nous caractériserons les VE produites par les CSMc (taille, quantité, teneur en protéines, marqueurs membranaires, structure) en utilisant les méthodologies classiques et d’autres plus nouvelles (Cytoflex S, MACSPlex). (3) Nous évaluerons les capacités d'immunomodulation des CSMc et des VE in vitro en utilisant le test d'inhibition de prolifération des PBMC, l'analyse des changements dans les sous-populations de PBMC, et le dosage ELISA des protéines immunomodulatrices sécrétées. (4) En utilisant une approche protéomique (réalisée par la société Olink), nous avons identifié des protéines impliquées dans le conditionnement et nous allons évaluer, comparer, combiner leur efficacité à l'aide d'un criblage à moyen débit afin d’en définir une combinaison optimale. (5) Nous comparerons in vivo les efficacités des CSM conditionnées par les PBMC ou par la combinaison optimale de molécules, et de leurs VE, dans notre modèle murin humanisé. Ce modèle est établi en greffant des fragments de thymus MG dans des souris immunodéficientes. Les paramètres biologiques et cliniques seront suivis à l'aide d'outils classiques (test d’aggripement, comportement, grille inversée) et de nouveaux outils (électromyographie, exercice volontaire) afin de comparer, dos à dos, les potentiels de ces approches cellulaires et acellulaires. Le projet permet des collaborations originales entre des équipes de chercheurs académiques, de cliniciens, et un laboratoire de thérapie cellulaire qui partagent des expertises en production et caractérisation de cellules et de VE, en criblage, en physiopathologie. En explorant les mécanismes immunorégulateurs des CSMc et de leurs VE, ce projet aura des retombées scientifiques fondamentales, et l’étude de leurs effets dans un modèle de MG pourra ouvrir des perspectives d’utilisation dans d’autres maladies auto-immunes.

Les brûlures représentent le quatrième type de traumatisme le plus fréquent à l’échelle mondiale. Entre 7 000 et 10 000 victimes par an doivent être hospitalisées pour des lésions plus préoccupantes, et 2 000 à 3 000 sont admises dans l’un des 23 centres de traitement des brûlés français.Chez les militaires évoluant sur le terrain, il est estimé que près d'un blessé sur dix est brûlé. Dans les brûlures profondes de grande taille, les plaies peuvent rester ouvertes et présentent un risque d'infection microbienne pendant des mois pouvant conduire à la septicémie. L'administration d'agents topiques et systémiques hautement efficaces est utilisée pour prévenir et traiter les infections. Plusieurs espèces de bactéries, dont Staphylococcus aureus, ont été associées à une résistance aux antibiotiques. Il est donc urgent de développer un traitement innovant pour améliorer la prise en charge des infections cutanées dans les brûlures. Le traitement candidat devra permettre de contrôler la prolifération microbienne dans les brûlures et être efficace contre les organismes multi-résistants et les biofilms et sans toxicité pour les tissus vivants comme les greffes de peaux. Ce nouveau traitement devra aussi favoriser les processus de cicatrisation cutanée et de réparation tissulaire. Le projet NovoPlasm vise à développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour améliorer la cicatrisation de plaies cutanées. Nous proposons d’utiliser la technologie des plasmas froids dans une approche multidisciplinaire fondée sur la collaboration entre physiciens, microbiologistes, spécialistes de la médecine régénérative et médecins. Le plasma froid génère à température ambiante des espèces réactives de l’oxygène et de l’azote au contact de l'air ambiant qui interagissent avec les plaies cutanées afin de stimuler leur cicatrisation et lutter contre les infections locales. Avec, NovoPlasm nous avons pour projet de réduire l'infection microbienne des plaies cutanées et la formation de biofilms ainsi que de favoriser la cicatrisation de ces plaies. Un prototype de source à plasma froid pour le traitement des brûlures sera mis au point et ses performances thérapeutiques pour la cicatrisation et le contrôle de l'infection seront testées in vitro et en essai pré-clinique in vivo. L’une des originalités du dispositif que nous souhaitons développer et caractériser est sa capacité à traiter des plaies étendues sans contact en utilisant une source « multijet » de plusieurs dizaines de cm2. Lors du projet initial « PlasmaSkin », nous avons démontré qu’un monojet de plasma froid stimule plusieurs mécanismes de la cicatrisation de brûlures sévères après greffe de peau et inactive les bactéries, y compris les souches résistantes aux antibiotiques classiques, en quelques minutes. Le consortium de NovoPlasm est constitué de l École Polytechnique, de l’Institut Pasteur, de l’Institut de Recherche Biomédicale des Armées (tous trois membres du projet initial) ainsi que de la société CTIBiotech. Cette PME développera, grâce à l’ingénierie tissulaire et à la bio-impression tridimensionnelle (3D), des équivalents de peau humaine, qui permettront de modéliser l'inflammation de la plaie et l’activation de cellules immunitaires phagocytaires. Ces modèles 3D in vitro ainsi qu’un modèle de brûlures reconstruites avec une greffe de peau humaine in vivo chez une souris humanisée seront utilisés pour tester l'efficacité du plasma froid à réduire la charge microbienne et les biofilms dans une plaies cutanées ainsi qu’à favoriser la cicatrisation des brûlures. Enfin, un modèle porcin sera utilisé pour tester l’efficacité du plasma froid sur la cicatrisation de brûlures cutanées septiques et aseptiques en utilisant les procédures chirurgicales de référence utilisées en clinique. Par ces différents modèles précliniques, le projet NovoPlasm permettra l’obtention de résultats ayant une pertinence clinique et donc un fort potentiel thérapeutique et commercial.

PEPITE est le fruit d’une collaboration entre l’UMR1197 et la PME Organotechnie. Son objectif est d’ouvrir un marché à forte valeur ajoutée pour les peptones d’Organotechnie en les intégrant à la production des cellules souches et de leurs produits de sécrétion, les vésicules extracellulaires (VE) en thérapie tissulaire, domaine d’innovation de l’UMR1197. Cette approche synergique apportera une innovation de rupture pour améliorer la sécurité et l’efficacité thérapeutique de ces produits. PEPITE sélectionnera les peptones les plus performantes en s’appuyant sur un partenariat effectif et multidisciplinaire : 1) L’UMR1197 gère des essais cliniques utilisant des cellules souches et maitrise les contraintes techniques et réglementaires liées. En plus de son unité de production GMP, elle dispose de locaux pré-GMP pour valider les étapes requises pour la production clinique. 2) Organotechnie développe et fabrique des peptones utilisées dans le diagnostic, la culture cellulaire et la fermentation. Elle fabrique déjà des produits de grade clinique destinés à la pharmacologie et maitrise les contraintes associées. Les peptones sont des mélanges hydrosolubles de polypeptides et d’acides aminés formés par l'hydrolyse partielle de matières premières riches en protéines, végétales pour ce projet. Elles sont des additifs efficaces à la culture cellulaire, mais elles ne sont pas validées pour la production de cellules souches et leurs dérivés en thérapie tissulaire. La thérapie tissulaire utilisant les cellules souches mésenchymateuses (CSM) est en plein essor. Les procédés d’isolement et d’amplification des CSM doivent être efficaces, reproductibles et sûrs, mais les additifs utilisés actuellement pour leur culture sont d’origine animale (sérum de veau fœtal (SVF)) ou humaine (lysat plaquettaire humain (hLP)) et présentent des verrous majeurs : une variabilité inter lots, une composition non définie et pour le hLP, des coûts de production élevés et un approvisionnement difficile. Les peptones végétales sont une alternative très prometteuse au SVF et au hLP pour préparer les produits de thérapie tissulaire. Par ailleurs, les CSM thérapeutiques présentent des risques potentiels liés à leur dissémination hors du site d’injection ou à l’apparition de mutations géniques éventuellement dangereuses à long terme. Leur stockage et acheminement au lit du patient sont aussi des contraintes. Toutefois, l’effet thérapeutique des CSM repose sur leur action trophique, les remplacer par les produits qu’elles sécrètent est envisagé par de nombreux spécialistes. Les VE sécrétées par les CSM présentent une efficacité analogue à celle des CSM sources, mais sont dépourvues d’ADN génomique, ne sont pas (ou peu) immunogènes et sont faciles à stocker et à transporter. Le SVF et le hLP contiennent de grandes quantités de VE qu’il est nécessaire d’éliminer avant la production de VE de CSM. Les peptones, dépourvues de VE, faciliteront beaucoup la production et la purification de VE de CSM tout en réduisant les coûts. Enfin, nous fractionnerons les peptones pour analyser l’efficacité des différentes fractions et mieux définir leur composition peptidique. Les sous-fractions les plus actives constitueront des nouveaux produits à forte valeur ajoutée. Cette caractérisation biochimique et fonctionnelle des peptones apportera une meilleure compréhension de leurs mécanismes d’action. Notre projet a pour ambition, grâce aux peptones PEPITE : -1) d’améliorer la sécurité et l’efficacité de la production des CSM thérapeutiques, -2) de permettre la production industrielle des VE pour la thérapie tissulaire, à des coûts beaucoup plus accessibles pour l’économie de la santé. Il valorisera l’écosystème scientifique relatif aux CSM et VE dans lequel l’UMR1197 évolue, avec Organotechnie comme partenaire industriel et commercial. Il sera aussi un tremplin pour la mise en place des conditions GMP nécessaires au développement de produits à base de VE et destinés à la clinique.

Le projet Dimelec allie les compétences de plusieurs laboratoires pour le développement d’une nouvelle méthodologie de traitements et d’analyses rapides d'échantillons biologiques adaptée pour le diagnostic d’urgence. L’objectif est de concevoir une plateforme d’analyse alliant la microfluidique, les nanobiotechnologies (synthèse et fonctionnalisation de nano-objets) et l’électrochimie (synthèse/matériaux, réactivité/ microélectrodes et électronique/ instrumentation) pour le multidosage de microARN circulants dans le sang. Ces nouveaux marqueurs sont spécifiques de certaines pathologies et, détectés de façon précoce dans le sang, ils constituent une source d’informations sur l’état d’avancement d’une affection et conditionnent la prise en charge efficace et rapide du patient. La stratégie choisie est l’association de différents étapes dans une plateforme d’analyse pour : (i) pré-traiter l’échantillon biologique (ii) capturer les microRNA ciblés à l’aide de nanoparticles (NPs) magnétiques fonctionnalisées (iii) relarguer les microRNA capturés par hyperthermie magnétique contrôlée (échauffement local, sans élévation globale de la température du milieu) et enfin (iv) détecter les microRNA dans des réseaux de microélectrodes fonctionnalisées. La multi-détection sera rendue possible grâce à un instrument adapté aux réseaux de microélectrodes en termes de spécificités et d'ergonomie d'utilisation, appareillage qui n’existe pas actuellement pour les applications dédiées couplant électrochimie et microfluidique. Au-delà de cette application dans le domaine du diagnostic médical, l’instrumentation qui sera développée répondra à un manque instrumental et sera précieuse aux communautés des microfluidiciens et électrochimistes, en particulier pour les applications dédiées aux sciences de l’environnement (pesticides, médicaments, métaux lourds) et la santé (anticorps, acides nucléiques, protéines-médicaments, enzymes, ...).

Les traumatismes représentent l’un des tous premiers facteurs de risque d’arthrose. La réparation des lésions ostéochondrales tôt après le traumatisme pourrait ainsi éviter ou retarder l’apparition de l’arthrose. Malheureusement, il existe un manque flagrant de solutions pour cette réparation. Le projet ARTiTHERA porte sur la mise en œuvre et l'évaluation d'une stratégie thérapeutique préventive innovante, basée sur une construction adaptable associant des pansements thérapeutiques et des cellules souches dérivées de la moelle osseuse. Le projet impliquera l'optimisation technologique, l'évaluation in vivo dans un modèle de rat arthrosique, la finalisation des études précliniques déjà validées et l'évaluation de la tolérance clinique de phase 1 par arthroscopie chez des patients souffrant d'une lésion traumatique du genou. Le kit ARTiTHERA prêt à l'emploi fournira deux pansements (os, cartilage), à utiliser selon le besoin. Par son action de pansement, ARTiTHERA va stabiliser la région lésée, permettant une réduction de l'inconfort, de la douleur et potentiellement du risque de développement de l'arthrose.

Notre projet a pour but de développer de nouveaux médicaments pour le traitements des cancers. Les cellules tumorales expriment un répertoire de protéines différent de celui des cellules normales. Un nouveau procédé extrêmement puissant, basé sur un mécanisme naturel, permet d’inhiber très spécifiquement la synthèse protéique. Notre objectif est de développer à partir de ce procédé des médicaments pour inhiber dans une même cellule tumorale la synthèse de plusieurs oncoprotéines pour entraîner la régression tumorale et empêcher au maximum le phénomène de résistance.