UMR3347/U1021 - Signalisation, Radiobiologie et Cancer

Le cervelet est essentiel chez tous les vertébrés à mâchoires pour le contrôle moteur et les fonctions cognitives. Les neurones cérébelleux proviennent principalement de deux niches germinatives : la zone ventriculaire et la lèvre rhombique supérieure (URL), un tissu spécialisé ayant des propriétés de niche pour les cellules souches neurales (NSC). Des études récentes ont révélé l'architecture de la lèvre rhombique humaine (RL) et comment des défauts dans son développement sont associés à divers syndromes humains. Ces découvertes remettent en question la vision centrée sur les rongeurs du développement de la RL, soulignant la nécessité de nouveaux modèles expérimentaux et une meilleure compréhension des voies et des gènes régissant les trajectoires de l'URL. Les facteurs T (TCF) sont des facteurs de transcription (TF) essentiels de la voie Wnt. L'activité des TCF et l'expression des gènes proneuraux Hairy et Enhancer of Split (Hes/Hey) sont des marqueurs clés de l'auto-renouvellement des NSC. L'activité des TCF et les transcrits Hes/Hey ont été détectés dans l'URL chez plusieurs espèces, mais leurs rôles et leurs interactions régulatrices dans la RL cérébelleuse humaine restent largement inconnus. Nos recherches montrent que les amphibiens sont un modèle pertinent pour étudier le développement de l'URL chez les vertébrés. Nous avons aussi découvert que les TF BARHL inhibent l'activité des TCF et influencent les décisions de destin cellulaire dans l'URL, probablement via des interactions avec les TCF, Groucho(GRO)/TLE et les HES. LockOnURL adopte une approche transdisciplinaire et multi-échelle combinant la biologie computationnelle, l'intelligence artificielle, les multi-omiques, la bioinformatique, la biologie moléculaire, la biochimie et la biologie du développement, allant des embryons de Xenopus aux organoïdes humains. L'objectif est de caractériser le réseau interactif TCF/TLE/BARHL/HES, en examinant sa structure 3D et son impact transcriptionnel sur la biologie de l'URL cérébelleuse Les objectifs de LockOnURL sont : 1. Identifier et valider les surfaces d'interaction et les déterminants de spécificité des protéines TCF, Gro/TLE, BARHL et HES, et développer un algorithme d'apprentissage profond pour prédire les interactions entre protéines désordonnées. 2. Définir les profils transcriptomiques et les trajectoires d'expression génique pendant la neurogenèse précoce chez les amphibiens à l'aide de techniques multi-omiques, y compris le séquençage de noyaux uniques (SN) et l'Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC), et les comparer aux mammifères. 3. Examiner comment l'altération de l'activité des TCF impacte la différenciation cellulaire et la progression dans l'URL/EGL. 4. Étudier l'activité des TCF dans les organoïdes cérébelleux humain et évaluer les effets de l'activation ou de l'inhibition des TCF sur le destin cellulaire de l'URL LockOnURL documentera les structures, les stœchiométries, les modifications post-traductionnelles et les partenaires d'interaction potentiels du réseau interactif TCF/TLE/BARHL/HES. Un outil computationnel sera aussi mis en place pour prédire les interactions entre protéines désordonnées. LockOnURL suivra les trajectoires cellulaires et les réseaux régulateurs de gènes dans le développement cérébelleux des amphibiens, tout en menant une comparaison inter-espèces des trajectoires de l'URL. LockOnURL vise à établir un modèle robuste pour étudier les changements développementaux nuisibles dans le développement précoce du cervelet. LockOnURL fournira des informations inédites sur le rôle de la signalisation TCF dans le développement cérébelleux. Le projet offrira également des informations sur les hiérarchies de développement dans la RL humaine, mettant en lumière les processus dérégulés dans les cellules cancéreuses et offrant des pistes pour des approches thérapeutiques potentielles.

Une question majeure en neurobiologie est comment des défauts d’organites ubiquitaires affectent des fonctions cérébrales spécifiques. Les cils primaires sont présents à la surface de l’ensemble des progéniteurs et neurones, pourtant leur dysfonctionnement chez l'homme entraîne des anomalies spécifiques du cerveau humain, en particulier du cervelet, dans les ciliopathies neurodéveloppementales comme le Syndrome de Joubert (SJ). La compréhension des mécanismes qui sous-tendent cette spécificité et, plus globalement, du rôle des cils primaires dans le développement du cervelet humain, reste encore fragmentaire faute de modèles humains. Récemment, par des approches d’organoïdes cerebelleux et spinaux à partir de cellules souches pluripotentes humaines, le Partenaire P1 a montré qu’une même protéine ciliaire jouait des rôles différents en fonction de l'état de différenciation des progéniteurs neuraux, et également qu’une nouvelle fonction de ce gène est spécifique du développement humain. Le projet CiCerO rassemble deux partenaires spécialistes du développement du cervelet, et aux expertises complémentaires sur les approches de différenciation cérébelleuse des iPSC et les approches multi-Omiques. Le but du projet est d'aborder les mécanismes de cette spécificité cellulaire au cours du développement cérébelleux humain, en se concentrant sur la structure, la dynamique et la fonction des cils primaires. Le projet a deux objectifs principaux : 1) Disséquer la fonction des protéines ciliaires et de ciliopathies dans le développement cérébelleux humain, 2) Comprendre comment au cours de la mise en place des différents lignages cérebelleux, la structure et la dynamique ciliaires sont régulées et influencent à leur tour le développement du cervelet. Nous utiliserons pour cela des approches de différenciation en cervelet d’iPSC humaines en 2D et 3D (organoïdes). Dans l'objectif 1, nous nous concentrerons sur deux gènes responsables du SJ, RPGRIP1L et TMEM67, qui codent pour des protéines de la zone de transition, une région à la base du cil contrôlant la composition et la fonction ciliaire. Étant structurellement et fonctionnellement différentes, ces protéines devraient contribuer différemment à la stabilité et à la composition des cils, et par conséquent au développement cérébelleux. Pour tester cette hypothèse, nous combinerons des études d'immunofluorescence, de scRNAseq, de protéomique et de phospho-protéomique des cellules cérébelleuses mutantes pour RPGRIP1L et TMEM67. À travers ces analyses, nous comptons 1) aborder le rôle des cils et de protéines de TZ distinctes dans l’établissement des trajectoires des progéniteurs cérébelleux 2) identifier les voies de signalisation altérées dans différents progéniteurs, et 3) identifier les régulateurs principaux de programmes spécifiques de ciliogenèse dans différents lignages cérébelleux. Dans l’Objectif 2, nous aborderons la spécificité de type cellulaire des cils primaires. Nous caractériserons les différences de structure et de contenu des cils entre différents types cellulaires au cours de la différenciation des progéniteurs cérébelleux humains, les corrélerons aux fonctions des protéines de la zone de transition découvertes dans l'Objectif 1. Pour cela, nous appliquerons des techniques d'imagerie à haute résolution pour étudier les changements spatio-temporels de structure et composition des cils. Nous mettrons en place un nouveau protocole pour purifier, analyser et comparer la teneur en protéines des cils issus de différents types de progéniteurs à différents stades de leur différenciation, afin de relier les caractéristiques structurelles des cils à leur composition moléculaire. Le projet CiCerO apportera des informations importantes sur la compréhension des rôles spécifiques des cils dans le développement du cerveau humain, mais nous aidera également à comprendre les maladies neurodéveloppementales humaines telles le syndrome de Joubert et les ciliopathies associées.

Nous proposons d'explorer une nouvelle approche radiothérapeutique, appelée radiothérapie par minifaisceaux d'ions (IONSMBRT), qui combine les avantages considérables des ions pour la radiothérapie et la remarquable préservation des tissus assurée par la radiothérapie par minifaisceaux (MBRT). La réponse des tissus normaux à la radiothérapie IONSMBRT dans les régions thoracique et abdominale ainsi que le contrôle des tumeurs dans un modèle murin de pancréas seront étudiés pour la première fois. La réponse tissulaire normale à IONMBRT dans les régions thoracique et abdominale sera étudiée pour la première fois. Le contrôle de la tumeur dans un modèle murin de pancréas sera également évalué pour la première fois après une MBRT à l'hélium et au carbone. Enfin, nous avons émis l'hypothèse que l'IONSMBRT pourrait permettre d'exploiter de manière synergique les caractéristiques physiques et les effets biologiques de la thérapie ionique (Ion RT) et de la MBRT. L'un des objectifs de cette proposition est de valider ou de réfuter cette hypothèse. Ces caractéristiques font de l'IONMBRT un excellent candidat pour les soins futurs aux patients. L'IONSMBRT pourrait être particulièrement utile pour le traitement des tumeurs radiorésistantes et immunosuppressives, telles que les gliomes. Dans ce projet, nous nous concentrerons sur des types de tumeurs mortelles, comme le cancer du pancréas. L'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est l'une des tumeurs solides dont les résultats thérapeutiques sont les plus mauvais, en raison de sa radio-résistance relative, de sa nature invasive (neuroinvasion) et de son diagnostic tardif.

La transition épithélium-mésenchyme (EMT) est un processus essentiel du développement, de la cicatrisation et des pathologies (fibrose, cancer), activée par une poignée de facteurs de transcription (EMT-TFs) contrôlant adhérence et motilité cellulaires. Bien que de nombreuses études aient exploré les propriétés de chacun de ces facteurs pris séparément, les connaissances actuelles de ces processus laissent des questions fondamentales totalement ouvertes, que ce soit au cours du développement ou du cancer [1]. Ce projet s'intéresse à la dynamique spatiotemporelle de co-activation de ces facteurs et à l'importance fonctionnelle de ces co-expressions pour l'accomplissement de la TEM et la migration des cellules. Nos questions sont: les EMT-TFs sont-il co-activés dans une cellule donnée à un temps donné? Existe-t-il des caractéristiques précises d'expression de ces facteurs, une combinatoire et une dynamique, reliées à des états cellulaires précis, ou bien y a-t-il une part de stochasticité dans l'activation spatio- temporelle de ces facteurs dans un tissu donné? Quand ils sont co-activés, coopèrent-ils moléculairement dans la même cellule pour, par exemple, activer des modalités différentes d'EMT? En combinant biologie cellulaire, embryologie moléculaire et bioinformatique, ce projet explore l'EMT de la cellule unique au tissu, en utilisant la crête neurale (CN), un modèle classique d'EMT manipulable par de nombreuses approches expérimentales in vivo et ex-vivo. Nous décrirons la dynamique de co-expression des EMT-TFs et de leurs régulateurs in vivo, en explorant les transcriptomes de cellules uniques et par des techniques d'hybridation in situ multiplexe. Cette partie produira la première cartographie de co-expression des EMT-TFs in vivo. Nous repousserons les limites de certaines approches actuelles (profondeur limitée des transcriptomes de cellules uniques, difficultés à détecter fiablement des hétérogénéités géniques..) en développant de nouveaux jeux de données (meilleure profondeur de séquençage, ciblage des cellules de la CN) et des nouveaux algorithmes avec deux partenaires spécialisés du domaine "single cell transcriptomics", L. Peshkin (Partenaire 3, Harvard Medical School, Dept Systems Biology, [2]) et I. Adameyko (Partenaire 4, U. Vienna [3]). Nous utiliserons des approches d'hybridation in situ quantitatives (à l'échelle de la cellule unique et de la molécule unique) avec T. Walter (Mines ParisTech, collaborateur externe [4]), pour produire une cartographie quantitative au cours du développement de la crête neurale. Pour comprendre l'impact fonctionnel de la coopération des EMT- TFs, nous manipulerons le réseau génique de l'EMT et sa régulation avec une suite d'outils moléculaires dédiés, afin d'analyser les paramètres fins de l'EMT et de la migration de la CN in vivo et in vitro. A.H. Monsoro-Burq (Coordinateur, Partenaire 1, I. Curie, U. Paris Saclay, [5, 6]) et E. Théveneau (Partenaire 2, U. Toulouse, [7, 8]) développeront une analyse intégrée des aspects développementaux et cellulaires des conséquences fonctionnelles des co-expressions des EMT-TFs. Notre projet apportera une vision nouvelle du contrôle et des modalités de la transition épithélium- mésenchyme, impactant largement les connaissances dans le contexte normal ou pathologique de ce processus cellulaire et tissulaire complexe. [1] Stemmler et al, Nat.Cell.Biol 2019; 10.1038/s41556-018-0196-y [2] Briggs et al., Science 2018, 10.1126/science.aar5780 [3] Soldatov et al., Science 2019; DOI:10.1126/science.aas9536 [4] Tsanov et al., Nucl Ac.Res.2016;10.1093/nar/gkw784 [5] Plouhinec et al., PLOS Biology 2017; DOI:10.1371/journal.pbio.2004045. [6] Scerbo and Monsoro-Burq 2020; Science Advances, DOI: 10.1126/sciadv.aaz1469 [7] Bajanca et al., Nature Communications 2019; DOI:10.1038/s41467-019-09548-5 [8] Yang et al, Nat Rev Mol Cell Biol. 2020, DOI: 10.1038/s41580-020-0237-9.