Laboratoire de biologie et pharmacologie appliquée

La résistance aux antibiotiques est un problème majeur de santé publique. Toutefois, le lien entre l’état physiologique des bactéries et l’efficacité des antibiotiques reste mal caractérisé. Notre projet propose d’y remédier en étudiant, à l’échelle de la cellule unique, l’effet de changements du taux de croissance d’Escherichia coli sur la sensibilité à un antibiotique entraînant des cassures du chromosome, la ciprofloxacine. Nous étudierons aussi l’impact de cet antibiotique sur un état physiologique particulier, sans paroi et à croissance lente, les formes L. Nous avons montré que les bactéries à croissance rapide meurent davantage après une exposition aux dommages à l’ADN que celles à croissance lente. De plus, l'induction de la réponse aux dommages de l'ADN (réponse SOS) varie en fonction du taux de croissance ce qui peut affecter la survie des bactéries. Pour découvrir les mécanismes moléculaires sous-jacents, nous allons : (i) Combiner la microfluidique et notre protocole de microscopie à molécule unique pour imager la réparation de l'ADN en temps réel et la corréler avec l'induction de la réponse SOS dans des conditions de croissance variées. Nous comparerons l’exposition à la ciprofloxacin avec un système génétique qui permet de produire des cassures du chromosome de manière controlée. (ii) Induire le passage à la forme L et caractériser la réponse de ces formes L aux dommages à l'ADN au niveau de cellules individuelles après avoir développé des dispositifs microfluidiques adaptés. (iii) Evaluer l'effet du fond génétique en comparant la sensibilité à la ciprofloxacine d'une collection de souches uro-pathogènes, qui présentent des différences significatives de taux de croissance dans des milieu nutritifs identiques. Nous quantifierons également leur capacité à produire la forme L et leur réponse en présence de ciprofloxacine dans ces conditions. Ce projet permettra de mieux comprendre l'importance de changements physiologiques retrouvés dans des conditions cliniques sur la sensibilité d'E. coli à la ciprofloxacine, avec une pertinence directe pour les infections des voies urinaires.

Les cellules utilisent la régulation allostérique comme mécanisme fondamental pour contrôler des processus critiques au niveau moléculaire. Les approches in silico de simulation moléculaire permettent des analyses détaillées et comparatives de la régulation allostérique, surtout lorsqu'elles sont associées à des données de cryo-EM et de méthodes biophysiques telles que le FRET à molécule unique (single molecule FRET, smFRET). Les canaux K+ à rectification entrante (Kir) contrôlent la perméation des K+ dans divers tissus, leur présence est ubiquitaire chez l’humain. Ce sont d’importants régulateurs de la signalisation électrique dans le cerveau, les muscles, le système cardiovasculaire. Ce sont également d’importants régulateurs dans les fonctions rénales. L’ouverture du canal est régulée par des modulateurs comme PIP2, des lipides anioniques, des microARN (miR1). Les mutations sur Kir2.1 causent de nombreuses pathologies comme le syndrome d’Andersen (AS). L'objectif est d’élucider le réarrangement dynamique des canaux Kir et des voies de régulation allostériques qui interviennent lors de l’ouverture du canal. Nous étudierons l’effet des régulateurs tels que le PIP2, les lipides anioniques et le miR1 ainsi que l’impact de deux mutants médicalement importants et potentiellement allostérique : R312H, un mutant perte de fonction et M301K, un mutant gain de fonction. Malgré les connaissances biochimiques détaillées des canaux Kir, le mécanisme par lequel les canaux Kir sont régulés reste vague. Comment les mutations rendent le canal dysfonctionnel reste également inconnu. Ce projet combine des approches expérimentales et théoriques innovantes qui intègre de la biologie structurale (cryo--EM) et biophysique de pointe (smFRET afin d'étudier la dynamique du canal) et de la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour accéder aux nombreux états de transition, (difficile expérimentalement) nous utiliserons des méthodes in silico, notamment une méthode computationnelle (MDeNM) récemment développée par le partenaire 2. A l'issue de ce projet, les structures à haute résolution du Kir2.1 WT humain et des mutants apo- et en complexe avec des modulateurs tels que PIP2, des lipides anioniques et le miR1 seront révélées. Les voies de régulation allostériques impliquées dans l’ouverture du canal et la compréhension de l'impact des mutations pathogènes sur la structure, la dynamique et la fonction des canaux Kir seront dévoilées. Ce travail pourra être fondateur pour la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques et en particulier le développement d’une classe innovante de médicaments à base d’ARN afin de traiter les pathologies musculaires, cardiaques et osseuses associés aux canalopathies dont le syndrome d’Andersen. Les axes e travail de KirFlex sont : i) Déterminer les structures à haute résolution du Kir2.1 WT humain et des mutants en complexe ou non avec PIP2, des phospholipides anioniques et un miR1 spécifique. ii) Étudier la fonction et la dynamique de ces canaux (WT et mutants) en utilisant smFRET et SPR. iii) Utiliser des méthodes informatiques pour interpréter et intégrer les résultats expérimentaux afin de déchiffrer les voies de régulation allostériques impliquées dans l’ouverture du canal et comprendre le mécanisme moléculaire du dysfonctionnement des mutants. Le consortium est transdisciplinaire et rassemble deux équipes complémentaires avec une expertise reconnue dans le domaine de la structure et fonction des canaux ioniques (Vénien-Bryan C, IMPMC- Sorbonne Université Paris partenaire 1), et dans l'intégration d'expériences et de méthodes informatiques pour étudier la dynamique macromoléculaire (Pasi M, ENS Paris-Saclay, partenaire 2). Le projet est ambitieux mais reste réaliste, compte tenu de l'expertise des partenaires et des résultats préliminaires déjà disponibles.

Notre projet a pour but d’élucider un mécanisme moléculaire permettant à la bactérie de détecter la présence de traces d’antibiotiques dans l’environnement. Des rapports alarmants indiquent que des concentrations environnementales d’antibiotiques influencent l’écologie microbienne et favorisent l’apparition de résistances. A des concentrations sous-inhibitrices, les antibiotiques déclenchent de faibles changements moléculaires et une adaptation détectable par des technologies « Omics » au niveau du transcriptome et du protéome. Ces changements contribuent à la tolérance et la résistance adaptative des bactéries face aux antibiotiques. Récemment, un mécanisme d’afflux de magnésium dû à l’expression de transporteurs du Mg2+ permettant à la bactérie de survivre au stress induit par des antibiotiques ciblant la traduction a été identifié. Cependant le mécanisme d’activation de l’expression de ces transporteurs reste inconnu. Le but du projet est de valider un modèle de contacts moléculaires utilisés par les bactéries pour « détecter » la présence d’aminoglycosides. Nos données préliminaires de transcriptomique, protéomique et de biochimie pointent un système à deux composants. Nous démontrons une interaction directe entre ces antibiotiques et la protéine kinase membranaire qui déclenche l’expression spécifique de gènes. Parmi ces gènes se trouve un transporteur membranaire pour le magnésium. Nous conforterons nos résultats sur des souches pathogènes par une série d’analyses transcriptomiques, protéomiques, biochimiques et structurales pour une forte valeur ajoutée au projet. Des expériences de réticulation in vivo et de résonance magnétique nucléaire in vitro nous donnerons les détails du mode d’interaction antibiotique-protéine avec ses conséquences fonctionnelles. Les résultats permettront de valider notre modèle où une protéine kinase membranaire interagit directement avec les aminoglycosides pour stimuler un afflux de Mg2+ en réponse au stress antibiotique.

Couplage ultrafort et ultrarapide de modes plasmoniques et photoniques pour des capteurs hautement efficaces (COUUPPLES). Les capteurs optiques permettent une interrogation à distance et s’appuient sur la disponibilité de nombreuses sources et détecteurs. Les nanoparticules (NP) métalliques sont largement utilisées car leur résonance plasmon de surface localisée est modifiée par de petites perturbations de leur environnement, permettant une sensibilité de détection élevée. Couplées avec un mode photonique résonnant d'une microcavité 1D en régime de couplage faible, les NPs d’or présentent une réponse ultrarapide fortement accrue et une largeur de résonance réduite. Il est même possible d'atteindre le régime de couplage ultra-fort. Une impulsion laser peut alors induire la modulation du régime de couplage d’ultra-fort à faible en moins d’une picoseconde. Notre projet en fera la première démonstration expérimentale en insérant au centre d'une cavité photonique un réseau de nanobâtonnets d'or alignés. La caractéristique d’anticroisement dans les courbes de dispersion des modes polaritons issus du couplage sera démontrée et la preuve du couplage ultra-fort établie. La susceptibilité élevée à l'environnement des NP des modes polaritons et leur dynamique seront exploitées pour réaliser de nouveaux capteurs avec une grande sensibilité et un grand volume effectif. Des cavités hybrides seront élaborées par nanofabrication et leur réponse optique analysée. La dynamique du champ proche sera déterminée par une approche de fluorescence pompe-sonde originale. Les cavités seront ensuite intégrées dans un environnement microfluidique et leur potentiel de détection sera testé à travers six configurations différentes de complexité croissante, de la simple interrogation par lumière monochromatique continue à l'exploitation des signatures spectrales et temporelles de la réponse optique transitoire ultrarapide du dispositif. La sensibilité de ces configurations de capteur aux changements de l'indice de réfraction dans l'environnement des nanobâtonnets d’or sera d'abord déterminée. Ensuite, un aptamère d’ADN sera greffé sur la surface des nanobâtonnets, capable de se lier à des biomolécules aussi bien de petite que de grande taille. Afin d'établir la preuve de concept de nos nouvelles voies de détection basées sur le plasmon localisé, nous choisirons comme analyte la thrombine, une protéine impliquée dans plusieurs maladies cardiovasculaires, ainsi que de petites molécules possédant des activités anticancéreuses et antivirales connues. Le projet sera réalisé à travers une approche interdisciplinaire réunissant trois laboratoires académiques : LuMIn pour l'investigation théorique et expérimentale de la réponse optique ultrarapide, L2n pour la nanofabrication et la caractérisation optique, et LBPA pour la bio-fonctionnalisation.

Les cellules établissent un réseau spectaculaire de protéines qui leur permet de recevoir et de traiter des signaux. Parmi les protéines essentielles orchestrant la signalisation, la famille des petites GTPases joue un rôle central en fonctionnant comme des interrupteurs moléculaires qui alternent entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP et qui transmet des signaux. Le cycle d'activation-inactivation des petites GTPases doit être étroitement contrôlé afin de garantir une action moléculaire appropriée et une spécificité de réponse aux signaux. Dans ce projet, nous nous intéressons à la petite GTPase Rac1, un régulateur clé de la motilité cellulaire, de l'endocytose et de la croissance. Rac1 est régulé par un ensemble des GEF et des GAP, qui permettent une réponse rapide et localisée aux perturbations afin d'assurer une polymérisation efficace de l'actine lors de la migration ou de l'adhésion cellulaire. En plus de ses régulateurs classiques, Rac1 possède également un régulateur atypique, Bcr (Breakpoint Cluster Region protein) qui porte à la fois les activités GEF et GAP. La fonction de Bcr n'est pas connue. Bcr a été essentiellement étudiée dans le contexte du chromosome de Philadelphie, l'anomalie génétique où la chimère Bcr-Abl est produite par réarrangement chromosomique et qui est impliquée dans la leucémie par une activité excessive de la kinase Abl1. Étonnamment, la façon dont le clivage au sein de Bcr lors du réarrangement affecte sa régulation de Rac1 n'a jamais été étudiée. De plus, le rôle de régulation de Rac1 par les activités GEF/GAP atypiques de Bcr n’est toujours pas compris. Mon objectif est de déterminer comment les activités GEF et GAP du régulateur atypique Bcr contrôlent l'activité de Rac1 à la périphérie de la membrane de manière quantitative, comment cette activité est soutenue par la structure Bcr et les changements de conformation lors de la liaison à la membrane. Ce projet va également éclaircir les dysfonctionnements de Bcr dans des pathologies.

La répartition asymétrique des lipides sur les deux feuillets qui composent les membranes cellulaires est une caractéristique fondamentale des cellules eucaryotes. Alors que la phosphatidylcholine et la sphingomyéline sont préférentiellement localisées sur le feuillet exoplasmique des membranes des voies sécrétoires/endocytaires tardives dans la plupart des types cellulaires, la phosphatidylsérine (PS), la phosphatidyléthanolamine et la phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate sont quasiment exclusivement trouvés sur le feuillet cytosolique. L’exposition de la PS sur le feuillet exoplasmique est un signal de reconnaissance des cellules en apoptose par les macrophages ou encore pour le déclenchement de la cascade de coagulation du sang. À l’intérieur de la cellule, la PS a un rôle essentiel dans la mesure où la charge conférée par ce phospholipide chargé négativement permet le recrutement de protéines à motifs polybasiques comme la petite GTPase K-Ras et la protéine EHD1, impliquée dans la fission membranaire, établissant un lien entre régulation de l’homéostasie de la PS et trafic vésiculaire. L’asymétrie des lipides est maintenue grâce à des protéines transmembranaires appelées flippases (ATPases-P4) qui transportent des lipides du feuillet exoplasmique au feuillet cytosolique des membranes cellulaires, aux dépens de l’hydrolyse de l’ATP. La plupart des ATPases-P4 forment un complexe avec les protéines de la famille Cdc50, et cette association est essentielle à l’adressage correct des ATPases-P4 ainsi qu’à leur activité de transport de lipides. Il a été démontré que la flippase de levure Drs2-Cdc50 transporte spécifiquement la PS et que ce transport contrôle le trafic entre endosomes et membranes du trans-Golgi (TGN). Par ailleurs, des mutations d’ATPases-P4 ont été associées à des troubles neurologiques ainsi qu’à des pathologies métaboliques et hépatiques, soulignant le rôle crucial de l’asymétrie des lipides pour un fonctionnement cellulaire normal. Nous avons précédemment démontré, par protéolyse ménagée, troncatures génétiques et données structurales à haute résolution, que l’activité du complexe Drs2-Cdc50 est autoinhibée par ses extrémités N- et C-terminales et activée par le phosphatidylinositol-4-phosphate (PI4P). Cependant, le mécanisme moléculaire qui sous-tend l’activation du transport de lipides par Drs2-Cdc50 reste énigmatique. Récemment, la petite GTPase Arl1 et la protéine Gea2, un facteur d’échange GDP/GTP pour la protéine Arf (Arf-GEF), ont été identifiées comme interagissant respectivement avec les extrémités N- et C-terminales de Drs2. De plus, Arl1 et Gea2 stimulent le transport de lipides par Drs2-Cdc50 sur des membranes de TGN isolées. Arl1 s’associe également à Gea2, suggérant un mécanisme complexe de régulation de l’activité de transport de lipides catalysé par Drs2. Sur la base de travaux antérieurs et de nos résultats préliminaires, notre hypothèse de travail est que la liaison d'Arl1 et de Gea2 aux extrémités N- et C-terminales de Drs2 lève l'autoinhibition et active ainsi le transport des lipides par Drs2-Cdc50. Ainsi, en associant des approches biochimiques, in silico, et structurales à moyenne/haute résolution, FLIPPER a pour ambition de disséquer ce mécanisme de régulation, en reconstituant in vitro le rôle activateur de Arl1 et Gea2 sur le transport des lipides. De façon à atteindre cet objectif, nous associerons notre expertise dans l'analyse structurale et biochimique des petites GTPases et des Arf-GEFs (J. Cherfils) avec des techniques de spectrométrie de masse structurale (C. Bechara), la détermination de la structure du complexe Drs2-Cdc50-Arl1-Gea2 par cryo-EM (J. Lyons/P. Nissen) et notre savoir-faire dans l’étude biochimique et de la fonction des flippases (G. Lenoir). Notre proposition vise à fournir une base mécanistique pour l'activation de Drs2-Cdc50 in vivo et à révéler de nouvelles fonctions pour les petits GTPases et les grands Arf-GEFs tels que Arl1 et Gea2.

LLes quadruplexes de G (GQ) sont des structures non canoniques d'acide nucléique qui se composent d'au moins deux quartets de guanines maintenues par des interactions d'empilement, des paires de bases Hoogsteen et une liaison avec un cation. Les topologies des GQ sont catégorisées en fonction de la direction relative de leurs brins. Les RNA GQ adoptent principalement la topologie parallèle, mais des topologies non parallèles ont aussi été décrites. Les GQ sont largement distribués dans les ARNm et les ARN non codants, où ils régulent l'expression des gènes. In vivo, les ARN GQ seraient dépliés par des protéines de liaison à l'ARN (RBP), telles que l'hélicase DHX36 et la protéine de liaison à l'acide nucléique à doigts de zinc (CNBP). Par conséquent, les ARN GQ sont des structures transitoires converties par les RBP entre leurs états replié et déplié. Pour explorer leur structure et dynamique ainsi que leur interaction avec les RBP, un ensemble limité de techniques est utilisé. Alors que la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN peuvent fournir structurales à l’échelle atomique, elles nécessitent des concentrations élevées et ne donnent que des informations dynamiques limitées (rayons X) ou sont limitées par la taille des molécules (RMN). Les techniques de fluorescence sont idéales pour suivre les interactions moléculaires et la dynamique sur une large plage temporelle et à faible concentration, mais souffrent de la nécessité d'introduire des marqueurs externes. De nombreux substituts de purine fluorescents ont été développés, mais déstabilisent généralement les GQ ou sont fortement inhibés. Dans ce contexte, notre objectif est de valider et d'appliquer tzG, un analogue fluorescent isomorphe de G de la famille des isothiazolo [4,3-d] -pyrimidines, développé par un partenaire du projet, comme outil pour caractériser site-sélectivement les conformations, la dynamique et les interactions moléculaires des ARN GQ. Pour atteindre ce but, nous avons réuni un consortium international multidisciplinaire d'experts, tous hautement reconnus dans leurs domaines respectifs. Le projet sera divisé en quatre tâches (WP) et une cinquième organisationnelle (WP0). L'objectif de WP1 est de synthétiser les séquences GQ marquées par tzG nécessaires au projet et de caractériser leurs structures. L'effet de tzG sur la topologie et la stabilité des GQ sera déterminé à l'aide de CD, d'expériences de dénaturation thermique et de spectroscopie RMN en présence d’ions K+ ou Na+. Pour les séquences présentant des spectres RMN bien résolus, la structure 3D sera déterminée pour caractériser finement l'impact de l'insertion de tzG dans les structures des GQ. Dans WP2, nous étudierons de manière approfondie la fluorescence stationnaire et résolue en temps des ARN GQ marqués au tzG en présence d’ions K+ ou Na+. L'interprétation des données à l'aide d'une approche combinée MD / QM devrait fournir une image complète de la photophysique de tzG dans les GQ qui sera essentielle pour rationaliser leurs propriétés spectroscopiques et interpréter leurs changements dans les complexes avec les RBP. Dans WP3, nous validerons tzG comme outil clé pour les ARN GQ en l'appliquant pour déchiffrer le mécanisme de dépliement/repliement des GQ par les protéines DHX36 et CNBP, grâce à une combinaison de RMN, spectroscopie de fluorescence et techniques d’écoulement à flux bloqué. Enfin, en utilisant l'ensemble des données du projet, l'objectif de WP4 sera d'affiner les méthodes et modèles d'interprétation en QM adoptés dans le projet et, de développer un hamiltonien excitonique pour l'étude de la dynamique à l’état excité de systèmes multichromophores. Au final, tzG devrait devenir le premier outil validé pour suivre fidèlement tout G substitué dans les GQ ARN, ce qui conduira à des percées dans la compréhension des propriétés des GQ et des mécanismes d'action des RBP.

Nos résultats préliminaires indiquent que la cytotoxicité liée au pneumocoque (PN), agent étiologique majeur de la méningite bactérienne, ainsi qu'à la pneumolysine (Ply), son principal facteur de virulence, implique la signalisation calcique régulée par les connexines (Cxs) composants les jonctions Gap intercellulaires. Dans un modèle murin d'infection, l'expression de la Cx43 astrogliale favorise la translocation de la PN dans le cerveau et la méningite. Nous avons également constaté que des facteurs sécrétés indépendants de Ply (PSFs) sont associés à la méningite à PN et déclenchent une signalisation calcique et la cytotoxicité des cellules endothéliales. Le but de ce projet est de caractériser ces PSFs, ainsi que leur rôle et celui de Ply dans la signalisation dépendante des Cxs et du Ca2+ à l’aide d’un modèle unique de barrière hémato-encéphalique (BHE) reconstitué in vitro. Le rôle des PSFs dans le franchissement de la BHE sera caractérisé dans le modèle de méningite murine à PN.

Les petites GTPases de la famille Rho, leurs régulateurs et leurs effecteurs assemblent des plates-formes moléculaires à la surface de membranes, qui contrôlent de multiples voies de signalisation. Ces plates-formes de signalisation interviennent dans de nombreuses fonctions et processus physiologiques de la cellule, tels que la régulation du cytosquelette, l'adhésion, la migration ou le cycle cellulaire. À l'instar de ces fonctions majeures, leurs dérégulations peuvent être à l'origine de pathologies humaines telles que des cancers ou des anomalies du développement. Cependant, la façon dont les défauts moléculaires dans les voies Rho résultent en des symptômes cliniques est extrêmement complexe et reste mal comprise. Dans ce projet, nous avons identifié des patients présentant des mutations faux-sens des petites GTPases CDC42 et RHOA, ainsi que de régulateurs en amont (le facteur d’échange DOCK1, qui stimule leur activation par l’échange GDP / GTP, et Galpha13, une sous-unité d’une protéine G hétérotrimérique qui recrute un Rho GEF), qui entraînent toutes une gamme de maladies cutanées invalidantes, souvent accompagnées de symptômes inflammatoires. Ces maladies rares de la peau offrent une opportunité unique de comprendre le fonctionnement des circuits moléculaires de Rho GTPases depuis la molécule jusqu’au malade. Dans ce but, ce projet regroupe quatre laboratoires représentant une gamme inhabituelle d'expertises complémentaires, comprenant la biochimie et la biologie structurale, la biologie cellulaire, la génétique et la médecine. Ce consortium étudiera le paysage mutationnel des voies Rho dans une cohorte unique de patients présentant des troubles cutanés, identifiera les défauts biochimiques et cellulaires associés aux mutations et enfin déterminera l'impact des mutations sur les voies de signalisation régulées par les Rho GTPases dans les cellules et dans un modèle génétique in vivo. Le projet devrait donc avoir un impact sur la recherche fondamentale et translationnelle de plusieurs manières. Grâce à son approche multi-échelles, il devrait offrir une compréhension sans précédent des fonctions des Rho GTPases et de leur dialogue avec les principales voies de signalisation. De ce fait, il devrait avoir un impact important sur la vaste communauté de chercheurs travaillant dans la biologie des petites GTPases. D’autre part, il devrait fournir des protocoles expérimentaux intégrés pour déchiffrer les défauts moléculaires chez les patients atteints de maladies causées par des mutations des GTPases. Ces maladies sont de plus en plus reconnues, comme en témoignent les résultats de la cohorte MUSTARD du centre de référence pour les dermatoses mosaïques à Dijon, qui représentent un modèle médical unique de maladies rares. Enfin, il devrait permettre de concevoir de nouveaux traitements médicamenteux ciblés pour ces patients, et éventuellement pour des maladies auto-inflammatoires plus courantes, visant directement leurs défauts fonctionnels et moléculaires. Nos résultats préliminaires suggèrent qu’une telle approche pourrait inclure la réutilisation de médicaments déjà approuvés sur le marché.

Zi Surfaces (Zéro Interférence Surfaces), spin-off du laboratoire de biologie situé à l’ENS Paris-Saclay, développe des chimies de surface innovantes appliquées aux biopuces et s’insère dans le marché des biocapteurs. Poser un diagnostic précoce d’une maladie, c’est-à-dire dès l’apparition des premiers symptômes, c’est permettre aux patients de bénéficier rapidement de traitements validés. Ceci implique d’être capable de détecter de très faible quantité ou variation en concentration d’un biomarqueur directement dans les fluides corporels les plus simples à prélever (sang, sérum, urine, salive…). Zi chimie de surface appliquée aux biopuces optimise l’immobilisation de (bio)récepteurs et élimine le bruit de fond pour une lecture directe et sensible des signaux détectés par tous les biocapteurs. Elle est robuste, extrêmement stable, réfractaire aux interactions non-spécifiques et universellement applicables à tous types de biomolécules.

Un défi de la biologie moderne est de comprendre comment les circuits de protéines permettent aux cellules de détecter les informations provenant de leur environnement et de prendre des décisions pour y répondre efficacement. Les petites GTPases sont parmi les acteurs les plus importants de la signalisation cellulaire, et elles sont impliquées dans la régulation de pratiquement tous les processus cellulaires. Un point commun à toutes les petites GTPases est leur capacité à fonctionner comme des commutateurs moléculaires par leur alternance entre une forme inactive, liée au GDP et une forme active, liée au GTP. Ce mécanisme d’apparence simple est en réalité extrêmement complexe, car de multiples signaux convergent vers chaque petite GTPase grâce à leurs nombreux activateurs (facteurs d'échange ou GEF, qui stimulent leur chargement en GTP), ce qui génère une réponse unique par la sélection d’un effecteur spécifique en aval. Inversement, le niveau de GTPases actives est contrebalancé par l’activité inhibitrice de leurs GTPase-activating proteins (GAPs), qui les inactivent en stimulant l'hydrolyse du GTP. De plus, tous ces mécanismes fonctionnent à la périphérie des membranes, qui en sont des composants importants. Par analogie avec les réseaux de télécommunication, les réseaux de GTPases peuvent ainsi être assimilés à des circuits moléculaires multiplexés, dans lesquels plusieurs entrées sont combinées en un seul signal (la petite GTPase) avant d'être décomposées en sorties spécifiques. A ce jour, les déterminants de la cinétique et de la spécificité des petites GTPases dans ce contexte multiplexé sont restés mystérieux. Notre hypothèse est que la spécificité de la signalisation provient de contributions multi-échelles: affinités différentielles (protéines), compositions moléculaires (complexes) et partitionnement spatial sur membranes (nanoclusters). Ce projet aborde ce problème par des mesures quantitatives de l’activation et de la signalisation in vitro et en cellules, avec comme système modèle la petite GTPase Rac1. Rac1 est un régulateur majeur de la motilité cellulaire, de l'endocytose et de la croissance cellulaire, et il est associé à de nombreuses pathologies telles que la tumorigenèse, les troubles du développement du système nerveux, les maladies cardiaques ou les infections. Cette petite GTPase est régulée par un très grand nombre de GEFs et de GAPs et transmet des signaux à divers effecteurs, et peut donc être considérée comme un archétype du multiplexage. La reconstitution de sa régulation et de son activité dans des conditions bien contrôlées permettant de quantifier les paramètres cinétiques de l'activation (échange GDP / GTP et hydrolyse du GTP) et de la signalisation (liaison aux effecteurs) sont une étape importante pour comprendre les caractéristiques de la signalisation cellulaire médiée par Rac1. En associant l'expertise du laboratoire Cherfils (ENS Paris-Saclay) dans la reconstitution de petites GTPases en membranes artificielles et du laboratoire Coppey (Institut Curie Paris) en optogénétique quantitative subcellulaire, notre objectif est d'identifier et de quantifier ces paramètres en intégrant des cinétiques in vitro utilisant des protéines purifiées et des membranes artificielles contrôlées (liposome et bicouche lipidique supportée) avec des mesures biochimiques en cellule dans lesquelles les concentrations de régulateurs sont contrôlées par optogénétique. Ces paramètres expérimentaux seront intégrés dans des modèles mathématiques de régulation et de signalisation de Rac1. Notre projet devrait fournir un « manuel d'instructions » moléculaire de Rac1 sur les membranes et générer des avancées conceptuelles qui élargiront notre compréhension des nombreuses facettes des petites GTPases. À plus long terme, ils devraient inspirer des stratégies à l’échelle du système moléculaire pour la découverte de médicaments inhibant les voies de signalisation contrôlées par la GTPase dans les maladies.

Chez les êtres vivants, la capacité des cellules à se déplacer sur des surfaces solides (motilité cellulaire) est universellement liée à la multicellularité. Chez les organismes eucaryotes, la motilité est nécessaire à la différenciation fonctionnelle de l’embryon, et au contrôle de l’homéostasie de l’organisme lors de la régénération des tissus ou de la réponse immunitaire. Chez les bactéries, la motilité cellulaire permet la formation de micro-communautés différenciées (biofilms) leur permettant de résister au stress environnemental. L’extrême résistance des biofilms aux antibiotiques et aux chimiques en général, en font un problème majeur de santé publique et pour l’industrie. Les mécanismes centraux de régulation semblent conservés malgré la distance évolutive qui sépare les deux grands domaines du vivant et implique les petites protéines G de la superfamille Ras. Chez les cellules eucaryotes, le nombre et la complexité des interactions entre ces protéines et leurs régulateurs a complexifié l’étude des mécanismes de régulation. De manière remarquable, la bactérie Myxococcus xanthus emploie une protéine G unique, MglA pour réguler sa direction de mouvement en réponse aux signaux environnementaux. Lorsqu’elle est associée au GTP, MglA localise au pôle avant des bactéries et active l’appareil de motilité. La régulation spatiale de MglA dépend d’une seconde protéine, MglB qui elle, localise spécifiquement au pôle opposé de la cellule. MglB fait partie des protéines à domaine Roadblock/Longin, une classe émergente de régulateurs de petites protéines G. Au pôle arrière, MglB agit comme une GTPase Activating Protein (GAP) de MglA et active spatialement l’hydrolyse du GTP associé à MglA, bloquant l’accumulation de MglA au pôle arrière. Remarquablement, l’axe de polarité formé par MglA et MglB est invertible, de sorte que lorsque les protéines se re-localisent simultanément aux pôles opposés (inversion), les bactéries change leur direction de mouvement dans la direction opposée. Le phénomène d’inversion est contrôlé par un système de transduction du signal de type chimiotaxie (Frz), permettant ainsi de réguler la motilité cellulaire en réponse aux signaux environnementaux. La disponibilité d’outils génétiques et cellulaires sophistiqués ainsi que le nombre restreint de régulateurs font de Myxococcus un modèle particulièrement attractif pour étudier le mécanisme de régulation de la motilité par MglA à haute résolution. Cependant, à l’heure actuelle de nombreuses questions demeurent irrésolues. Partant d’observations préliminaires, ce projet collaboratif regroupant trois équipes de compétences complémentaires propose d’explorer trois questions principales : (i) Comment MglB régule t-elle l’hydrolyse du GTP par MglA et ce mécanisme est-il conservé chez les protéines de cette famille ? (ii), Par quel mécanisme le système Frz provoque-t-il la relocalisation spatiale de MglA et MglB ? (iii), comment la régulation de la motilité par le système MglAB permet-elle l’émergence de comportements multicellulaires ? En combinant des approches réductionnistes de molécules et de cellules individuelles à des approches plus globales de modélisation nous chercherons à définir de nouvelles pistes de recherche pour comprendre comment l’intégration de comportements unicellulaires permet la coopération de milliers de cellules, une question d’intérêt général en biologie développementale et évolutive.