Biologie de la reproduction, environnement, épigénétique et développement

The development of assisted reproductive technologies (ART) has provided an alternative for people with difficulties conceiving naturally, and over 9 million babies have been born through ART since 1978. Moreover, the use of ART has increased dramatically (5.3-fold) during the last two decades and this trend will continue. While ART have undoubtedly made a positive impact on the lives of couples and individuals dealing with infertility, numerous studies reported potentially negative ART-derived effects on the health of offspring. The mechanisms involved and their consequences are poorly understood and there are critical unanswered questions, including whether the manipulations and the artificial environments in which gametes and embryos are cultured, or the increased paternal and maternal age at the time when the treatments are applied entail ART-derived health risks. Thus, there is a growing need to advance research on ART consequences and propose holistic solutions, as well as to develop innovative training programmes to prepare new researchers to deal with such concerns. The AFRODITA (Advancing Fertility and Reproduction thrOugh Dedicated and Innovative Technological Applications) consortium takes up this challenge and aims to implement jointly an innovative international, multi-sectorial, and multidisciplinary research and training programme (Joint Doctorate) by bringing together key scientific staff from the academia (5 European universities and 3 excellent research centres), the largest hospital in Denmark and the corporate world (8 enterprises) with a history of fruitful collaboration, that will guarantee excellent training and effective supervision for AFRODITA’s 15 doctoral candidates to enhance their career opportunities for different professional paths.

This proposal describes concept development and conceptualisation of a EuroFAANG (European Functional Annotation of ANimal Genomes) infrastructure to realise the full potential of genotype to phenotype (G2P) research across species, breeds and populations of farmed animal species in Europe. To achieve accurate G2P predictions, it is necessary to be able to refine and characterise highly complex traits as sets of intermediate informative phenotypes along the entire cascade from genome to cell, organism, environment, population and across different environments. The goal of the EuroFAANG infrastructure is to streamline use of interdisciplinary capabilities for G2P research in terrestrial and aquatic farmed animals and provide transnational access to all of the relevant facilities, expertise and knowledge to European stakeholders. This will address the need to bring together national facilities at the pan-European level in the field of animal genetic resources, phenotyping and breeding, and animal health, which was identified as a gap in the infrastructure landscape by the 2021 ESFRI Roadmap. The proposal builds on the foundation provided by the five current H2020 EuroFAANG projects, AQUA-FAANG, BovReg, GENE-SWitCH, GEroIMO and RUMIGEN and connects with existing infrastructures for data management and animal agriculture in the European research infrastructure landscape. The institutions and organisations involved have world-leading expertise in fundamental and applied farmed animal science and consolidated established connections to European stakeholders in farmed animal science. The outcomes of this proposal will lead to better alignment of the development of the research infrastructures landscape for the advancement of excellent farmed animal science and frontier G2P research in Europe and globally.

La production in vitro d'embryons (PIV), d’une importance croissante pour la reproduction animale, est largement utilisée en élevage bovin. Cependant, le développement d'embryons fécondés in vitro reste inefficace, puisqu’un tiers seulement des embryons bovins in vitro donnent des blastocystes. L'une des causes supposées de l'arrêt embryonnaire précoce est l'échec de l'activation du génome embryonnaire (EGA). Cette période critique pour le développement est caractérisée par un remodelage global de la chromatine et une activation progressive de la transcription, elle a lieu entre le stade 4- et 8 cellule chez le bovin, mais reste mal connue. Ainsi, l’ambition de REPRO2BOS est de mieux comprendre cette période essentielle et de développer des stratégies pour en améliorer l’efficacité. Le facteur de transcription (TF) DUX, exprimé juste avant l'EGA, joue un rôle important dans le développement chez la souris et semble même critique pour l’embryon humain. DUX est un facteur pionnier, capable de se lier à la chromatine compactée et de recruter une histone acétyltransférase (HAT), ce qui entraîne hyperacétylation de l'histone H3 sur la lysine 27 (H3K27ac), reprogrammation de la chromatine et activation de gènes cibles clés de l’EGA. Ces évènements de remodelage de la chromatine sont complexes, avec des vagues successives d’acétylation/déacétylation, qui permettent une régulation fine de la progression de l’EGA. Les enzymes modifiant la chromatine utilisent comme substrats ou cofacteurs des métabolites spécifiques, dont la disponibilité est critique dans la régulation de l’EGA. Par ailleurs, la surexpression de DUX dans les cellules souches embryonnaires (CSE) humaines et murines induit une reprogrammation vers un état de type totipotent. Ces cellules, au transcriptome proche d’embryons au stade EGA, ont un potentiel de développement plus important que les CSE conventionnelles. Notre projet est basé sur les prémices suivants obtenus chez le bovin: (1) des motifs de liaison à DUX sont présents dans des régions du génome active avant l’EGA ; (2) l’orthologue bovin DUXC est exprimé dès avant l’EGA ; (3) la neutralisation de DUXC à l’aide de siRNAs induit un arrêt de développement. Les objectifs de REPRO2BOS sont de déchiffrer le rôle et la régulation de DUXC dans le développement de l'embryon bovin, mettre en place un modèle cellulaire de reprogrammation des CSE bovines vers un état similaire au 8C, élucider les liens entre disponibilité de métabolites spécifiques et remodelage de la chromatine. Une meilleure compréhension du rôle de DUXC dans les embryons et les CSE bovines pourrait non seulement améliorer l'efficacité de la PIV, mais aussi élargir les applications potentielles des cellules souches. REPRO2BOS sera organisé en 4 tâches : La tâche 1 vise à compléter nos expériences préliminaires sur l'expression de DUXC au cours du développement embryonnaire et l'effet de sa déplétion sur l'expression des gènes (RNAseq) et le remodelage de la chromatine (H3K27ac par CUT&Tag et ATACseq). Dans la tâche 2, nous établissons un modèle cellulaire inductible pour activer l’expression de DUXC dans les CSE bovines et en étudier les conséquences sur le transcriptome ainsi que la régulation du gène. Les cibles génomiques de DUXC seront déterminées. La tâche 3 étudie les liens entre l'activité de DUXC et l'acétylation des histones après induction de DUXC dans les cellules. Enfin, la dernière tâche étudie comment de petites molécules peuvent être utilisées pour moduler la reprogrammation de l'épigénome, avec l'objectif ambitieux de contrôler cette période clé et d'améliorer le développement embryonnaire in vitro. Au final, nous espérons que notre projet aura des applications importantes pour les technologies de la reproduction chez les animaux d'élevage et développera des modèles innovants conformes aux règles 3R.

Une meilleure compréhension des événements précoces de la reproduction est un enjeu majeur en élevage bovin, où les taux d’échecs restent élevés, avec typiquement 40% avant 7 jours de gestation. Les spermatozoïdes (spz) en route vers l’ovocyte subissent une sélection drastique, doivent acquérir leur pouvoir fécondant et survivre jusqu’à l’ovulation : ces événements ont lieu dans l’oviducte, où se déroule aussi la fécondation, en présence de microflux de fluide oviductal. Dans l’isthme de l’oviducte, une fraction des spz se lie aux cellules épithéliales, formant un « réservoir spermatique fonctionnel », tandis que d’autres spz se dirigent directement vers le lieu de la fécondation. Des études in vitro ont permis d’identifier certains acteurs moléculaires des interactions spz-oviducte et un impact positif de ces interactions sur la viabilité et la capacitation des spz. Cependant, les modèles utilisés sont éloignés de la physiologie complexe de la lumière de l’oviducte. Par ailleurs, le rôle des interactions entre spz et oviducte reste mal compris : le réservoir spermatique sélectionne-t-il les spz les plus aptes à féconder et à former un embryon viable ou, au contraire, piègent-ils les moins bons ? La liaison des spz au réservoir déclenche-t-elle une réponse moléculaire et fonctionnelle de l’oviducte ? Quel en est l’impact pour le développement embryonnaire ultérieur ? Le projet SELECT vise à répondre à ces questions en combinant pour la première fois un modèle innovant d’organoides d’oviducte bovin à la microfluidique. SELECT rassemble deux unités INRAE spécialistes des événements précoces de la reproduction bovine et le laboratoire Applied Microfluidics for BioEngineering Research de l’Université de Twente (Pays-Bas) pour son expertise en microfluidique appliquée à la biologie de la reproduction. Les connaissances générées par SELECT permettront d’améliorer la longévité des animaux d’élevage et développer de nouvelles stratégies de conservation de la biodiversité.

Le projet PaterLeg s’interesse à la question émergente de l'héritage des petits ARN non codant sncRNAs du sperme et de leur potentiel à façonner le développement de l'embryon et à transmettre d’éventuels phénotypes acquis par le père. Le décryptage du "code de l'ARN du sperme" et de ses conséquences sur l'expression des gènes de la progéniture pourrait faire évoluer le domaine vers des applications dans les domaines de la médecine humaine de la reproduction et de l'élevage de précision. Nous souhaitons ici évaluer dans quelle mesure les sncRNAs du sperme peuvent influencer le développement précoce de l'embryon de mammifères. Nous utiliserons pour cela l'embryon bovin comme modèle d'embryon non rongeur. En effet la souris présente des caractéristiques particulières de régulation du développement précoce, qui n’en font pas toujours un modèle pertinent pour les autres mammifères. De plus, l'impact économique des biotechnologies du sperme et de l'embryon dans la sélection génétique est important pour la filière bovine. Nous évaluerons d'abord l’apport paternel en sncRNAs à l'embryon précoce, en le comparant au contenu de l'ovocyte et aux sncRNAs synthétisés par l'embryon lui-même. Nous explorerons ensuite le rôle des sncRNAs hérités du père par des expériences de surexpression ou d’inhibition artificielle dans l'embryon, de petits groupes de sncRNAs sélectionnés parmi les scnRNAs différentiellement présents dans les spermatozoides de taureaux fertiles versus subfertiles, et/ou acquis tardivement par le spermatozoide, au cours de son passage dans l’épididyme. Les embryons résultants seront phénotypés par une analyse morphocinétique de leur développement préimplantatoire, l’intégration des données RNAseq et sncRNAseq et par analyse de leur protéome. Grâce à des approches mathématiques originales, des réseaux de gènes seront déduits des ensembles de données temporelles et interventionnelles générées par PaterLeg afin de formuler et de valider de nouvelles hypothèses sur le rôle des sncRNA du sperme. PaterLeg améliorera donc nos connaissances des mécanismes moléculaires régissant le développement des mammifères. Il ouvrira également la possibilité d'améliorer le développement embryonnaire précoce par de nouvelles approches biotechnologiques et contribuera à la validation de sncRNAs candidats comme marqueurs de la fertilité des taureaux.

L'arrêt méiotique homogène est une pathologie rare qui empêche la formation des spermatozoïdes ou cause un arrêt ovarien prématuré, à l’origine d’une infertilité pour laquelle il n’existe aucun traitement aujourd’hui. Des résultats récents confirment une hétérogénéité génétique, mais il n’existe aujourd’hui aucune uniformisation de la description du phénotype testiculaire, ni de validation fonctionnelle des variants génétiques identifiés chez la femme et l’homme. L’objectif du projet MEIOBLOC, suite à l’établissement d’une filière nationale, est de permettre de mieux définir les arrêts de la spermatogenèse et de confirmer l’impact fonctionnel des variants identifiés par le développement de modèles murins et cellulaires. Enfin, plusieurs approches de thérapie génique visant à rétablir la spermatogenèse dans des modèles murins d’arrêt méiotique seront envisagées afin d’évaluer la faisabilité et la sécurité de cette approche en vue d’une éventuelle application clinique.

Chez les animaux en captivité, de production ou pas, les conditions d'hébergement sont souvent appauvries et monotones, elles limitent l'expression des comportements naturels, altèrent divers indicateurs de bien-être et marqueurs de santé et accroissent la préoccupation du public pour le bien-être animal. L’enrichissement du milieu a été proposé comme une stratégie pour complexifier et dynamiser l'environnement, afin que les animaux puissent développer des répertoires améliorés de comportement naturel. Les odeurs ont été reconnues comme de bons candidats faciles à mettre en œuvre pour des enrichissements environnementaux positifs afin de soutenir les comportements et le bien-être, mais leur utilisation est encore largement négligée. Pourtant, les odeurs peuvent bénéficier aux animaux captifs et d'élevage, améliorant leur bien-être, leur prise alimentaire et leurs performances cognitives à l'âge adulte. Cependant, des effets controversés et/ou non durables sont observés lorsque ces odeurs sont associées à l'environnement maternel. Cela suggère que la robustesse des effets comportementaux peut dépendre du contexte gestationnel dans lequel l'odeur est apprise, qui a été peu étudié dans des contextes positifs, principalement pour moduler les préférences alimentaires, mais jamais évalué pour d'autres traits comportementaux importants, tels que l'ingestion ou le comportement socio-émotionnel, deux facteurs qui participent évidemment à une évaluation positive du bien-être. Enfin, les conséquences à long terme d'une exposition maternelle aux odeurs sur le développement et le fonctionnement du cerveau, en incluant l'épigénétique comme base sous-tendant la transmission intergénérationnelle de comportements innés basés sur les odeurs, restent à déchiffrer. Le projet HAPPYSMELLING examine l'impact d'un renforcement positif associé à une exposition gestationnelle aux odeurs sur la programmation des comportements alimentaires et socio-émotionnels de la progéniture dans deux périodes importantes de stress, à savoir la naissance et le sevrage. Le projet est mené en parallèle sur deux modèles animaux complémentaires, la souris et le porc, deux espèces nidicoles à maturation cérébrale périnatale, privilégiant des questionnements scientifiques et méthodologiques complémentaires, offrant ainsi des bénéfices croisés évidents à ce défi. En effet, chez la souris, le projet combine des investigations comportementales sur la prise alimentaire et les interactions sociales avec des analyses moléculaires sur les structures liées à la perception des odeurs pour identifier de nouveaux gènes et voies de régulation soutenant la plasticité neurodéveloppementale, avec un focus sur la méthylation de l'ADN comme facteur épigénétique contribuant aux modulations du comportement. En parallèle, dans une perspective translationnelle, la faisabilité d'un apprentissage prénatal des odeurs est menée chez le porc, une espèce souvent élevée en milieu appauvri, où l'exposition aux odeurs pourrait agir sur le stress, fournissant ainsi des stratégies nouvelles et faciles à mettre en œuvre pour améliorer le bien-être dans des élevages conventionnels. Comme l'état de bien-être d'un animal sensible est une affaire très complexe et ne peut être embrassé par une seule discipline scientifique, ce projet multidisciplinaire intégre le comportement et le bien-être des animaux avec des approches d'éthologie, de neurochimie, d'épigénétique et de physiologie générale.

La sélection bovine a permis une amélioration considérable des performances des bovins laitiers en quelques décennies, alors qu’une grande part de la variance phénotypique reste inexpliquée. POLYPHEME explorera les interactions entre polymorphismes de séquence et méthylation de l'ADN chez le bovin, dans le but de proposer de nouvelles stratégies de sélection. Nous aborderons (i) le contrôle génétique de la méthylation de l’ADN, avec l’identification de « quantitative trait loci » de méthylation (meQTL), (ii) la corrélation de la méthylation de l’ADN, sous contrôle génétique ou non, avec les performances propres ainsi que celles de la descendance, (iii) le rôle de la méthylation de l’ADN dans la dynamique et la stabilité du génome bovin, à travers l’identification de néo-mutations et de sites de recombinaison dépendants de la méthylation. POLYPHEME rassemble 3 partenaires complémentaires en termes d’expertise et d’accès aux ressources biologiques et aux plateformes : INRAE BREED (méthylation de l’ADN), INRAE GABI (génomique/génétique quantitative), ALLICE (prédiction de la fertilité, accès aux taureaux commercialisés). POLYPHEME aura pour objet d'étude la semence bovine, car le méthylome spermatique est crucial pour la fertilité mâle et pourrait également avoir un impact sur le développement embryonnaire ainsi que sur le phénotype de la descendance. De plus, la méthylation de l’ADN est relativement stable dans la lignée germinale mâle, suggérant que le méthylome spermatique pourrait refléter la méthylation de l’ADN au moment où la recombinaison homologue prend place et où les mutations transmises à la génération suivante apparaissent. Pour (i), les méthylomes spermatiques de 500 taureaux seront analysés par « reduced representation bisulfite sequencing » et des études d’association au niveau de la séquence complète seront menées pour identifier les meQTL. La concordance des meQTLs et des performances mesurées sur les taureaux (fertilité) ainsi que sur leurs filles sera examinée. Pour (ii), les effets épigénétiques multi-générationnels seront distingués de la méthylation sous contrôle génétique, donc héritable, par le biais de variations intra-individuelles du méthylome spermatique corrélées aux performances de la descendance. Un modèle de génétique quantitative étendu à l’épigénétique sera ensuite appliqué pour explorer l’impact de la méthylation spermatique sur les phénotypes. Pour (iii), les mutations récentes et les évènements de recombinaison homologue seront identifiés chez 40 vaches soigneusement sélectionnées dérivant à 95% de 40 ancêtres dont elles sont séparées par 4-6 générations. Nous déterminerons ensuite si le taux de mutation des CpG et la fréquence de recombinaison homologue dépend du statut de méthylation dans la lignée germinale des ancêtres. Les retombées de ce projet seront avant tout fondamentales, mais il utilisera des ressources générées par la sélection bovine et les résultats en découlant faciliteront l’interprétation biologique de la masse de QTL identifiés jusqu’à présent. De plus, la connaissance des mécanismes génétiques pilotant les variations héritables du méthylome pourrait permettre de sélectionner une population bovine présentant une plasticité génomique accrue, ce qui pourrait constituer un avantage dans le contexte actuel de changement climatique et d’instabilité environnementale. Enfin, quel que soit le volume de données traité, les études d’associations ne permettent d’expliquer qu’une partie des caractères physiologiques complexes et des maladies. Les mécanismes moléculaires sous-tendant cette « héritabilité manquante » ne sont pas connus, mais l’intervention de processus épigénétiques dans ce phénomène est une hypothèse plausible. L’intégration de ces processus épigénétiques transmissibles aux méthodes d’évaluation génomiques pourrait constituer une innovation de rupture qui révolutionnerait le monde de l’élevage.

La population générale, dont les femmes enceintes, est exposée à de nombreux perturbateurs endocriniens, tels que les phtalates et les phénols synthétiques (PSP). Ces substances entrent dans la composition d’un grand nombre de produits de consommation comme les plastiques, les résines époxy, les cosmétiques et les emballages alimentaires entre autres, exposant ainsi quotidiennement les femmes enceintes par ingestion, inhalation et/ou voie cutanée. Cette exposition représente un risque élevé pour la santé anténatale et post-natale de la descendance. Les objectifs de MEMORI sont d'évaluer si l’ingestion maternelle d’un mélange de PSP, suspecté d'affecter le poids placentaire et le poids de naissance, perturbe la fonction placentaire et induit des signatures placentaires spécifiques de cette exposition, affectant le phénotype de la descendance, avec des réponses spécifiques au sexe. Pour répondre à ces objectifs translationnels et intergénérationnels, le programme MEMORI s’appuiera sur 3 approches complémentaires : 1) la cohorte mère-enfant SEPAGES, dédiée à la surveillance de l'exposition aux substances chimiques - notamment les PSP - pendant la grossesse, et de leurs effets sur la santé des enfants jusqu’à l’âge de 5 ans. Cette cohorte comprend également des échantillons biologiques de mères et de leurs enfants; 2) un modèle in vitro de cellules trophoblastiques isolées du placenta humain à terme, permettant de décrypter les effets et les mécanismes moléculaires des PSP ; 3) un modèle biomédical lapin, pertinent en terme de placentation et de production de stéroïdes par les gonades pendant la vie fœtale, similaires à celle de l’homme. Ce modèle est également approprié pour étudier l’orientation des cellules germinales vers la voie mâle ou femelle, la toxicité fœtale et les effets à long terme chez les descendants adultes. Grâce au modèle animal in vivo, les effets de l'exposition maternelle, par ingestion, à un mélange de PSP, mimant l’exposition des mères de la cohorte SEPAGES, seront évalués sur le développement et la croissance fœto-placentaire mais aussi sur le phénotype postnatal, en particulier le statut cardio-métabolique et la fonction gonadique, en tenant compte du sexe de la progéniture. Parallèlement, le suivi des enfants de la cohorte SEPAGES se poursuivra jusqu’à l’âge de 7 ans, et inclura des mesures biométriques. Le modèle des cellules trophoblastiques humaines nous permettra d’étudier le mécanisme d’action des PSP ainsi que les signatures épigénétiques placentaires spécifiques de l'exposition seule ou en mélange à ces composants. Les signatures épigénétiques établies dans les cellules trophoblastiques in vitro seront recherchées et validées dans les placentas de lapin et humains issus de la cohorte SEPAGES. Enfin, les marques placentaires seront corrélées aux phénotypes postnataux mis en évidence dans le modèle de lapin, permettant ainsi d’extrapoler les potentiels risques phénotypiques des enfants à plus long terme. Ces résultats seront cruciaux car ils permettront aux autorités publiques nationales ou européennes (ANSES, EFSA), de mettre en place des recommandations au cours de cette période de sensibilité qu’est la grossesse.

Chez les mammifères, cellules germinales (CG) et acide rétinoïque (ATRA) sont les clés du succès de la reproduction sexuée. L’ATRA, requis à une étape cruciale de la différenciation des CG mâles, a longtemps été cité à tort comme l’inducteur de l’entrée en méiose dans l’ovaire. Les travaux récents des 4 équipes partenaires du projet ARDIGERM ont brisé ce dogme, tout en révélant des rôles fondamentaux de l’ATRA d’une part dans la prolifération des CG fœtales, qui conditionne la réserve de follicules ovariens, et d’autre part dans l’achèvement du processus méiotique dont dépend la production de gamètes haploïdes génétiquement équilibrés. Ils mettent par ailleurs en exergue l’existence d’un facteur testiculaire inhibant l’entrée en méiose, dépendant de CYP26B1 mais différent de l’ATRA. Le projet ARDIGERM a pour but de caractériser les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces nouvelles fonctions de l’ATRA et d’identifier le facteur inhibiteur de la méiose chez 3 espèces, dont l’Homme.

La reproduction saisonnière est une réponse adaptative cruciale pour faire face aux changements environnementaux annuels. Afin de permettre la naissance des petits aux printemps, les espèces se reproduisent durant le printemps (gestation courte, hamster) ou durant l’automne (gestation longue, mouton). Nos travaux ont identifié un rôle important pour deux peptides hypothalamiques dans le contrôle de la saisonnalité: RFRP3 (RF-amide Related Peptide 3) et KISS1 (Kisspeptin). Le rôle de RFRP3 demeure énigmatique mais nos résultats suggèrent qu’il joue un rôle clé dans la régulation temporelle de la saisonnalité, probablement via KISS1. Nous allons donc invalider ce gène chez le mouton et le hamster, définir l’ensemble des gènes exprimés par les neurones RFRP3 ainsi que les relations entre neurones RFRP3 et KISS1. Ces études clarifieront le rôle potentiel de RFRP3 dans le circuit qui régule la reproduction saisonnière.

Listeria monocytogenes est un contaminant alimentaire bactérien provoquant une zoonose dangereuse, la listériose. Les mécanismes de virulence de ce pathogène ont été abondamment étudiés, mais son portage asymptomatique chez l’hôte est peu compris. Nous avons découvert une phase de persistance intracellulaire de Listeria qui pourrait expliquer ce portage. Cette phase s’accompagne d’une transition phénotypique des Listeria, qui entrent dans un état de dormance dans une niche vacuolaire. Les objectifs du projet PERMALI sont de mettre au point des outils et méthodes de détection des Listeria intracellulaires persistantes, et de les utiliser sur des modèles ex vivo et des échantillons cliniques (homme-animal). Les résultats permettront une meilleure connaissance des stratégies adaptatives développées par L. monocytogenes pour nicher, de façon indétectable, chez ses hôtes. Ils génèreront des méthodes diagnostiques et de gestion du risque, permettant de mieux dépister la Listeria.