DifKin — Une Ser/Thr kinase impliquée dans la résistance à des composés antimicrobiens importants pour la colonization chez Clostridium difficile

Clostridium difficile (CD) est la principale cause d’infections nosocomiales intestinales après une antibiothérapie. L’impact des infections à CD (ICD) à l’hôpital est considérable en terme de mortalité, de morbidité mais aussi du cout généré par ces infections. En raison de la nature insatisfaisante des thérapies actuelles pour les ICD, il y a un besoin urgent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires contrôlant les étapes clés des ICD pour faciliter le développement de stratégies ciblant certaines étapes de l'infection pour développer de nouvelles thérapies préventives et/ou curatives. Notre but est de déterminer le rôle de PrkC, une Ser/Thr kinase dans l’homéostasie de l’enveloppe et la colonisation de l’hôte. Nous avons déjà montré que PrkC contrôle les premières étapes du cycle infectieux comme la germination des spores, la résistance à des antibiotiques favorisant les ICD comme les céphalosporines, aux peptides antimicrobiens, une des premières lignes de défense de l’hôte et aux sels biliaires qui sont toxiques pour les cellules végétatives. Les mécanismes de résistance de CD à ses composés restent peu caractérisés. Nous allons dans un premier temps identifier les composants de l’enveloppe (pepdidoglycane et/ou polysaccharides) touchés dans leur abondance ou leur structure lorsque PrkC est inactivé. Pour déterminer l’implication dans la fonction de PrkC des 2 domaines PASTA et du motif atypique présent en C-terminal spécifique à PrkC de CD, nous étudierons leur rôle en utilisant des formes tronquées de PrkC. Afin d’identifier des substrats de PrkC, nous utiliserons ensuite une approche de type phosphoprotéomique combinée avec une stratégie génétique d’isolement et d’identification par un séquençage de nouvelle génération de suppresseurs de la mutation prkC qui restaurent la résistance aux composés antimicrobiens. PrkC et certains substrats d’intérêt seront analysés par des approches de biologie moléculaire, de génétique et de biochimie pour comprendre le rôle physiologique de cette kinase et de ses cibles dans le contrôle de l’homéostasie de l’enveloppe et de la résistance aux composés antimicrobiens. Pour déterminer le rôle de PrkC et de ses substrats dans la colonisation du tube digestif et l’adhésion aux cellules intestinales, nous réaliserons des tests d’adhésion sur des cellules épithéliales puis nous utiliserons des modèles animaux adaptés. Afin de définir la conséquence de chaque événement de phosphorylation dans la physiologie de CD, des souches portant des mutations phosphoabblatives ou des mutations phosphomimétiques au site de phosphorylation de chaque cible seront construites et leur phénotype analysé. En conclusion, nous espérons déterminer quels sont les substrats de PrkC et quelles sont les conséquences physiologiques de leur phosphorylation. DifKin pourrait permettre d’obtenir une vision assez complète du réseau kinase-substrats, de déterminer le rôle régulateur de PrkC dans le contrôle de la résistance à des composés antimicrobiens et des ICD. Ce projet pourrait aussi déboucher sur des nouvelles stratégies de combat contre ce pathogène majeur.