SyntRNA — Chemo-biologie pour la characterization structurale et fonctionnelle de complexes ARN-protéines

En plus de ses fonctions clés dans la synthèse des protéines et dans la régulation des gènes, de nouvelles propriétés des ARN sont constamment découvertes. Pour comprendre la biologie des ARN, il est nécessaire de développer de nouvelles méthodologies de synthèse pour modifier leurs structures. Notre objectif concerne la mise au point de méthodologies post-synthétique pour bi-fonctionnaliser des ARN et obtenir ainsi des ARN réactifs ou comportant des sondes permettant leurs détections et leurs purifications. Les réactions chimiques que nous allons utiliser seront la ligation de « Staudinger traceless » et un couplage pallado-catalysé de Suzuki-Miyaura. Ces réactions donneront la possibilité d'obtenir une grande variété d'ARN bi-fonctionnels qui présenteront un large intérêt dans l’étude de la biologie des ARN. Dans le projet, ces ARNt fonctionnalisés seront utilisés pour explorer l’interaction des ARNt avec les amino-acyltransférases de la famille Fem, enzymes qui catalysent une étape essentielle de la synthèse du peptidoglycane de la paroi de Staphylococcus aureus. Chez cette bactérie pathogène, une chaîne latérale penta-glycine est assemblée par trois transférases qui ajoutent séquentiellement un (FmhB) ou deux (FemA and FemB) résidus Gly. Un premier objectif sera de synthétiser un analogue stable Gly-tRNAGly contenant un fluorophore à diverses positions des boucles D et T de l’ARN. La synthèse s’effectuera à partir d’un azido-ARN, qui réagira via la ligation de Staudinger traceless, avec une phosphine comportant le motif glycine pour former une liaison amide. L'introduction du fluorophore sera basée sur le couplage de Suzuki-Miyaura entre un iodo-ARN et un acide boronique lié au fluorophore. Le précurseur iodo-azido-ARN sera obtenu par chimie des nucléosides suivie d'une étape de synthèse sur support solide et d'une ligation enzymatique. Les ARNt bi-fonctionnalisés seront utilisés pour étudier le mode de reconnaissance des iso-accepteurs spécifiques des Gly-tRNAGly qui participent préférentiellement à la synthèse du peptidoglycane plutôt qu’à la synthèse protéique. Des données préliminaires suggèrent que l'utilisation préférentielle d'iso-accepteurs est due à des interactions spécifiques entre les boucles D/T des ARNt et le domaine coiled-coil de FmhB. Pour explorer ces interactions, un quencher de fluorescence sera introduit à différentes positions du coiled-coil de FmhB. Une diminution du signal de fluorescence de notre ARN bi-fonctionnalisé sera observée si le fluorophore dans la boucle D/T est à proximité du quencher porté par FmhB. Notre méthodologie de post-fonctionnalisation donnera la possibilité de modifier facilement la position du fluorophore et du quencher. Un test basé sur le quenching de fluorescence sera développé pour déterminer l'affinité de FmhB pour des ARN non-marqués. Pour une deuxième application, un motif électrophile sera introduit à l'extrémité 3' de l'ARNt pour générer des liaisons covalentes avec des résidus du site actif de FmhB. Cette approche permettra d’explorer la réactivité des résidus catalytique de FmhB et également de produire des complexes stables ARN-FmhB pour une utilisation en cristallogenèse. Les ARNt électrophiles seront également utilisés comme sondes pour identifier des protéines inconnues qui interagissent avec le substrat ARNt de FmhB, telles que des enzymes de maturation d'ARNt. Une dernière partie du projet concernera la processivité de la transférase FemA, c'est-à-dire la capacité de l'enzyme à ajouter deux résidus Gly. Nous avons envisagé trois modèles pour cette réaction incluant le transfert séquentiel de Gly à la chaîne latérale en croissance ou à l'assemblage d'un motif Gly-Gly sur l'ARNt ou sur FmhB avant le transfert au précurseur du peptidoglycane. Pour étudier ces modèles, nous allons générer divers analogues Gly-ARNt stables, en particulier un analogue de Gly-Gly-tRNAGly.